3. Kultur Sel Hewan 604p4y

KULTUR SEL HEWAN: PRINSIP & APLIKASI MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI 2016

KULTUR SEL HEWAN • Kultur sel : proses menumbuhkan sel prokariotik, eukariotik hewan dan tumbuhan di bawah kondisi yang terkendali • Pertama kali ditemukan oleh Ross Harrison tahun 1907. • Sel yang bisa dikultur : jaringan ikat (fibroblast, tulang, otot, epitel, saraf (tapi tidak berproliferasi in vitro) dan berbagai macam sel tumor & kanker

KULTUR SEL • Manfaat kultur sel hewan : 1. Model riset : menggantikan penggunaan hewan uji 2. Test toksisitas : efek obat 3. Riset kanker : riset bhn kimia yg msbbkan sel normal berubah mjd sel kanker 4. Virologi : kultivasi virus utk produksi vaksin, 5. Genetic engineering : produksi protein skala besar, produksi virus utk vaksin 6. Terapi gen / kloning : penggantian sel yg tidak berfungsi normal

PRINSIP DASAR KULTUR SEL • Medium harus aseptik dan steril . • Medium harus menyediakan semua nutrien yang diperlukan oleh sel . • Medium harus mempunyai pH 7.0 – 7.4

JENIS KULTUR SEL HEWAN • Berdasarkan spesies/organisme: • • • • • • • •

Manusia Mencit Tikus Monyet Ikan Anjing Tumbuhan Drosophila

JENIS KULTUR SEL HEWAN • Berdasarkan tipe organ/jaringan • • • • • • • •

Kanker Embrio Sel darah Kelenjar mammae Ginjal Saraf Hepar Dsb

JENIS KULTUR SEL HEWAN • Berdasarkan galur 1. Sel primer • • • •

Diisolasi langsung dr jaringan Mempunyai sifat mirip dg sel hidup pd organisme Tidak membelah selamanya (ada batasan pembelahan) Kariotipe normal (genom lengkap)

2. Galur sel • Diisolasi dari jaringan kanker atau sel normal yg telah diubah • Membelah selamanya (tidak ada batasan) • Kariotipe sering tidak normal/lengkap

JENIS KULTUR SEL HEWAN • 3. Embrionic stem cell • • • •

Diisolasi dr ICM (inner cell mass) embrio Pembelahan tidak terbatas Kariotipe normal Mempunyai sifat pluripotent (kemampuan berdiferensiasi mjd banyak sel)

JENIS KULTUR SEL HEWAN Berdsarkan teknik/metode : • Kultur suspensi • Kultur adherent/adhesi

JENIS KULTUR SEL HEWAN Kultur adherent cell • Sel dicuci dg larutan PBS (free Ca & Mg) • Tambahkan tripsin/EDTA membentuk lapisan tipis pd disk • Inkubasi disk suhu 37 C selama 1-2 menit. • Ketuk wadah dari sisi tepi utk mengeluarkan sel • Tambahkan medium utk mengeluarkan semua sel Kultur suspensi • Lebih mudah dikeluarkan dari wadah • Dengan menambahkan/mengencerkan

MEDIUM KULTUR • Medium 1. Serum : penting utk kebanyakan sel cth. 10% FBS (fetal bovine serum) • Medium tanpa serum ( hanya utk beberap jenis sel) • pH sangat penting Kandungan serum : • Nutrien dasar • Hormon dan growth factor • Faktor binding/pengikat : albumin, vitronectin, transferrin • Hormon, vitamin, mineral • Inhibitor protease • pH buffer

MEDIUM KULTUR 2. Antibiotik : penicilin, streptomisin 3. age medium : utk melepaskan sel biakan yg menempel di wadah kultur • Utk kultur adherent : Tripsin, kolagenase, dan/atau EDTA : memecah molekul adhesi antara sel dgn petri dish • Utk kultur suspensi : cukup dgn pengenceran sel dgn medium

METODE STERILISASI • Medium kultur tidak boleh di-autoklaf • Cara sterilisasi: disaring dg membran 0,2 mikron

WADAH KULTUR • Biasanya berupa plastik yg terbuat dari polistirene • Hanya 1 kali pakai

KONTAMINAN • Bahan kimia : • Endotoksin, • Bahan plastik • Ion metal • Desinfektan yg melekat pd wadah • Bahan biologis : mikoplasma, yeast, bakteri, fungi, • Sisa kultur yang telah terkontaminasi

DAMPAK KONTAMINASI • Kontaminan akan bersaing dg sel kultur mengambil nutrien dr medium • Kontaminan mensekresikan senyawa asam atau basa yg menghambat pertumbuhan sel kultur • Kontaminan dapat mendegradasi arginin dan purin, dapat menghambat sintesis asam nukleat • Memproduksi H2O2 yang toksik bagi sel

DETEKSI KONTAMINASI • • • • • • • • •

Kontaminasi dapat dideteksi dari beberapa hal : Medium menjadi keruh Penurunan tingkat pertumbuhan sel kultur PH medium menjadi basa Sel kultur menjadi multinukleus Sitoplasma sel banyak terdapat vakuola Ditemukan badan inklusi Lisis sel Sel tidak lagi menempel pada wadah

• Cara terbaik menghilangkan kontaminasi adalah membuang kultur yg telah terkontaminasi

SEL HeLa • Kultur sel HeLa atau HeLa cell line merupakan continuous cell line (galur sel yg terus membelah) yang diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (cervix) seorang wanita penderita kanker servix bernama Henrietta Lacks yang meninggal akibat kanker pada tahun 1951 • Kultur sel ini memiliki sifat semi melekat dan digunakan sebagai model sel kanker. • Sel HeLa ini cukup aman dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel • HeLa bersifat imortal yang tidak dapat mati karena tua dan dapat membelah secara tidak terbatas selama memenuhi kondisi dasar bagi sel untuk tetap hidup masih ada. • Strain-strain baru dari sel HeLa telah dikembangkan dalam berbagai macam kultur sel, tapi semua sel HeLa berasal dari keturunan yang sama.

SEL HeLa • Sel HeLa terbentuk akibat infeksi human papillomavirus 18 (HPV 18) • Sel HeLa diketahui mengekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 dan E7 terbukti dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia • Protein E6 dan E7 dari HPV memodulasi protein seluler yang mengatur daur sel. Protein E6 berikatan dengan tumor suppressor protein p53 dan mempercepat degradasi p53 yang diperantarai ubiquitin. Protein E6 juga menstimulasi aktivitas enzim telomerase. Protein E7 dapat mengikat bentuk aktif terhipofosforilasi dari p105Rb dan anggota lain dari famili Rb. Ikatan ini menyebabkan destabilisasi Rb dan pecahnya kompleks Rb/E2F yang berperan menekan transkripsi gen yang diperlukan untuk cell cycle progression • Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur RPMI 1640serum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai kofaktor enzim