Bab 4 2u3i5f

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1.

Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dan rancangan yang digunakan adalah metode Post Test Only Control Group Design. Merupakan rancangan penelitian dimana hasil penelitian diamati setelah perlakuan selesai. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

4.2.

Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan Juni-Juli 2015. 4.3. Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1. Populasi Populasi penelitian adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain wistar, jenis kelamin jantan, umur 2-3 bulan, berat badan 180-200 gram dengan kondisi sehat yang ditandai dengan gerakannya yang aktif dan bola mata yang jernih. 4.3.2. Sampel Sampel diambil secara acak dari populasi tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar sebagai hewan coba. Sampel terdiri atas 5 kelompok yang diambil secara acak.

43

44

4.3.3. Besar Sampel Pada penelitian ini terdapat 5 kelompok perlakuan, yaitu satu kelomok kontrol negatif, satu kelompok kontrol positif, dan tiga kelompok perlakuan (tikus yang diinduksi alkohol kadar 40% dengan dosis 2 ml). Estimasi besar replikasi yang digunakan pada penelitian ini mengikuti rumus Federer sebagai berikut: (r-1) (p-1) ≥ 15 (r-1) (5-1) ≥ 15 (r-1) (4) ≥ 15 4r-4 ≥ 15 r ≥ 4,75 r ≥5 Keterangan: p = perlakuan r = jumlah sampel per perlakuan Dari rumus ini didapatkan jumlah sampel minimal 5 ekor tiap kelompok. Sampel dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu 1 kelompok negative, 1 kelompok kontrol positif, dan 3 kelompok perlakuan. Sehingga jumlah sampel menjadi 25 tetapi jumlah ini akan ditambah dengan antisipasi drop out sebanyak 10% dari jumlah keseluruhan. Koreksi besar sampel untuk antisipasi drop out dengan perhitungan sebagai berikut (Saryono, 2011). n1 =

n 1f

n1 =

25 110

n1 =

25 0,9

n1 = 27,78 ≈ 28 ≈ 30 Keterangan :

(Saryono, 2011)

45

n1 = jumlah subyek yang direncanakan diteliti n = besar sampel yang dihitung f = perkiraan drop out Jadi jumlah sampel penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 ekor tikus ditambah 10% drop out sehingga total sampel yaitu 30 dengan jumlah ulangan perlakuan dalam 1 kelompok sebanyak 6 kali. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 6 ekor tikus sebagai berikut: a. Kelompok 1 : Tidak dipapar oleh alkohol maupun pemberian ektrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) (sebagai kontrol negatif). b. Kelompok 2 : Dipapar 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari tanpa pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) (sebagai kontrol positif). c. Kelompok 3 : Dipapar 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) dengan dosis 20 mg/200 grBB/hari selama 21 hari. d. Kelompok 4 : Dipapar 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) dengan dosis 40 mg/200grBB/hari selama 21 hari. e. Kelompok 5 : Dipapar 2 ml/100grBB/hari ml alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) dengan dosis 80 mg/200grBB/hari selama 21 hari. 4.3.4. Teknik Pengambilan Sampel Teknik pengambilan sampel dalam penelitian ini adalah total sampling yaitu pengambilan seluruh sampel yang ada pada setiap kelompok perlakuan di tempat penelitian. 4.3.5. Karakteristik Sampel Penelitian a. Kriteria Inklusi 1. Tikus putih (Rattus norvegicus) umur 8-12 minggu. 2. Berat badan 180-200 gram.

46

3. Jantan, strain Wistar. 4. Sehat, ditandai dengan pergerakan yang aktif dan bulu tebal berwarna putih serta mata yang jernih. b. Kriteria Eksklusi 1. Tikus yang pernah dipakai saat percobaan sebelumnya. 2. Tikus yang mati dalam penelitian. 4.4. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 4.4.1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) per oral dengan berbagai dosis. 4.4.2. Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar methemoglobin tikus putih. 4.4.3. Definisi Operasional Penelitian a. Alkohol Alkohol yang digunakan jenis ethanol dengan kadar 40% yang akan diberikan dalam dosis 2 ml/100 grBB/ hari selama 21 hari. b. Ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) Ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) adalah ekstrak yang diperoleh dengan dari 100 gr biji anggur merah kering yang dilarutkan dengan etanol 96% kemudian diuapkan dan didapatkan ekstrak biji anggur kental berwarna ungu kemerahan. Pada penelitian ini digunakan ekstrak kering biji anggur merah dengan dosis 20 mg/200grBB/hari pada kelompok perlakuan ketiga, 40 mg/200 grBB/hari pada kelompok perlakuan keempat, dan 80 mg/200grBB/hari pada kelompok perlakuan kelima yang akan diberikan selama 21 hari. c. Kadar methemoglobin Oksidasi besi ferro hemoglobin akan membentuk methemoglobin yang tidak dapat mengangkut oksigen. Kadar methemoglobin dalam darah akan diukur dengan menggunakan alat spektrofotometri dengan cara mengukur

47

absorbansi oksihemoglobin dan absorbansi deoksihemoglobin. Kadar methemoglobin (dalam bentuk persentase) dihitung dengan cara nilai absorbansi

oksihemoglobin

deoksihemoglobin

dan

dikurangi

hasilnya

dengan

dikalikan

dengan

nilai

absorbansi

seratus

persen.

Methemoglobin terdapat dengan jumlah yang sangat sedikit di dalam darah 4.5.

normal. Kadar methemoglobin normal adalah berkisar 0% - 1%. Alat dan Bahan Penelitian A. Alat Untuk Mengambil Darah Tikus 1. Handscoen. 2. Alat bedah minor. 3. Papan bedah. 4. Label. 5. Spluit 3 cc. 6. Tabung reaksi. 7. Rak tabung reaksi. 8. Mikropipet (10 μL – 100 μL) 9. Mikropipet yellow tip. 10. Kuvet. 11. Spektrofotometer. B. Bahan 1. Hewan percobaan. 2. Makanan tikus. 3. Sampel darah. 4. Aquadest. C. Alat Perawatan Tikus 1. Kandang tikus. 2. Penutup kandang dari anyaman kawat. 3. Timbangan. 4. Botol air. 5. Tempat makan tikus. D. Bahan Penelitian 1. Ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.). 2. Alkohol 40%. 3. EDTA. E. Alat Lain 1. Kamera digital. 2. Mikroskop. 3. Sonde. 4. Neraca berat badan.

48

4.6.

Alur Penelitian Sampel yang memenuhi kriteria inklusi Adaptasi hewan coba selama 7 hari

Pemberian pakan standar BR-1 dan minuman biasa

Kelompok II Kelompok III Kelompok IV Kelompok V Kelompok I Kontrol Ekstrak biji anggur Ekstrak biji Ekstrak biji kontrol Positif merah dengan dosis anggur merah anggur merah negatif Pemberian 20 dengan dosis 40 dengan dosis 80 Tanpa alkohol 40% mg/200grBB/hari mg/200grBB/hari mg/200grBB/hari pemberian 2ml/100grBB/ + alkohol 40% + alkohol 40% 2 + alkohol 40% 2 induksi hari selama 2ml/100grBB/hari ml/100grBB /hari ml/100grBB/hari alkohol dan 21 hari selama 21 hari selama 21 hari selama 21 hari ekstrak biji anggur merah selama 21 hari Setiap tikus dianestesi dengan kloroform pekat ± 0,67 ml/hewan coba secara inhalasi

Pengambilan sampel darah tikus sebanyak 3 ml dengan menggunakan spluit 3 ml Pengukuran kadar methemoglobin menggunakan spektrofotometri:  Mengukur absorbansi Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin  Kadar Methemoglobin = (absorbansi Oksihemoglobin – absorbansi Deoksihemoglobin) x 100%

Analisis data Menggunakan uji Normalitas, uji Homogenitas, uji ANOVA, uji Tukey, uji korelasi dan analisis regresi

49

Gambar 4.1 Diagram Alur Peneltian

4.7. Prosedur Penelitian 4.7.1. Pembagian Kelompok Tikus Tikus yang digunakan sebanyak 30 ekor yang terbagi menjadi 5 kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 6 ekor tikus (1 ekor tikus sebagai cadangan). a. Kelompok 1: diberi pakan standar dan tanpa pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.). b. Kelompok 2: diberi 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari tanpa pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.). c. Kelompok 3: diberi 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) sebanyak 20 mg/200grBB/hari selama 21 hari. d. Kelompok 4: diberi 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) sebanyak 40 mg/200grBB/hari selama 21 hari. e. Kelompok 5: diberi 2 ml/100grBB/hari alkohol 40% selama 21 hari dengan pemberian ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) sebanyak 80 mg/200grBB/hari selama 21 hari. 4.7.2. Adaptasi Proses adaptasi hewan coba dalam kandang dilakukan selama 7 hari dengan tujuan agar tikus dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru.

4.7.3. Penentuan Dosis Ekstrak Biji Anggur Merah Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya menjelaskan bahwa ekstrak biji anggur merah (Vitis vinifera L.) dengan dosis 100 mg/kgBB/hari (Ragab et al, 2013), 200 mg/kgBB/hari (Hassan et al, 2010) dan 400 mg/kgBB/hari (Lavay et al, 2009) secara peroral memiliki efek menghambat stres oksidatif. Biji anggur (Vitis

50

vinifera L.) memiliki kandungan proantosianidin paling tinggi dibandingkan dengan

yang

terkandung

pada

buah

lainnya.

Jumlah

kandungan

total

proantosianidin dalam biji buah anggur (Vitis vinifera L.) sebanyak 3532,3 ± 105,8 mg per 100 gr biji anggur segar (Gu et al, 2004). Sehingga ekstrak biji anggur merah yang akan diberikan yaitu: 100 mg Kg BB

=

=

100 mg 1000 gr BB

20 mg 200 gr BB

Dosis diberikan 20 mg/200grBB/hari dalam 1 ml. 200 mg Kg BB

=

=

200 mg 1000 gr BB

40 mg 200 gr BB

Dosis diberikan 40 mg/200grBB/hari dalam 1 ml. 400 mg Kg BB

=

=

400 mg 1000 gr BB

80 mg 200 gr BB

Dosis diberikan 80 mg/200grBB/hari dalam 1 ml.

4.7.4. Penentuan Dosis dan Pengenceran Alkohol

51

Kadar alkohol yang diberikan pada kelompok hewan perlakuan adalah kadar 40% sebanyak 2 ml. Agar mendapatkan alkohol dengan kadar 40% maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan rumus pengenceran sebagai berikut: n1.V1 = n2.V2 keterangan: n1 = Nilai kadar alkohol yang diinginkan (ml) n2 = Nilai kadar alkohol acuan (%) V1 = Volume kadar alkohol yang dinginkan (ml) V2 = Volume kadar alkohol acuan (%) Pembuatan kadar alkohol 40% dengan volume 2 ml sebagai berikut: n1.V1 = n2.V2 40% . 2 ml = 96% . V2 40 . 2ml V2 96 V2 = 80/96 V2 = 0,83 ml ≈ 0,8 ml Agar didapatkan alkohol sebanyak 2 ml maka dibutuhkan aquadest 1,2 ml. 4.7.5. Pemaparan Alkohol Mengambil tikus yang sudah dikelompokkan berdasarkan perlakuan secara satu persatu. Pengambilan tikus dilakukan secara hati-hati dan perlahan dimaksudkan agar tikus tidak stress dan tidak takut. Tikus dipegang dengan cara memegang badan tikus dan meletakkan bagian ekor serta menjepit antara badan dan leher pada jari antara kelingking dengan jari manis, lalu menyilangkan kaki depan tikus dan menjepitnya pada jari antara jari telunjuk dan jari tengah, sedangkan posisi kepala tikus siap diberikan alkohol. Kemudian sonde dimasukkan secara perlahan melalui sudut mulut agar tikus tidak menggigit sonde, sonde dimasukkan ketika tikus melakukan gerakan menelan/menggerak-gerakkan lidahnya, sehingga sonde tidak melukai bagian dalam mulut tikus. Setelah sonde masuk hingga bagian esofagus baru larutan alkohol dimasukkan. 4.7.6. Proses Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba a. Proses Anastesi

52

Proses

anastesi

dilakukan

satu-persatu

terhadap

hewan

coba

yaitu

denganmemasukkan hewan coba kedalam toples kaca yang berisi kapas yang telah dicampur dengan kloroform. Anastesi dilakukan secara inhalasi pada hewan coba dengan dosis eter ± 0,67 ml/hewan coba selama ± 60 detik yang dihitung dengan menggunakan stopwatch. b. Proses Pembedahan dan Pengambilan Sediaan Darah Setelah hewan coba teranastesia dengan baik, hewan coba diletakkan pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba difiksasi pada meja lilin dengan menggunakan jarum pentul. Dengan menggunakan pisau bedah, dilakukan pembedahan pada abdomen hingga setinggi leher. Kemudian dengan menggunakan spluit 3 cc, darah hewan coba diambil dari ventrikel kiri sebanyak 3 ml untuk melihat kadar methemoglobin dalam tubuh hewan coba. Setelah hewan coba dibedah selanjutnya tikus dijadikan satu lalu dikubur. 4.7.7. Penghitungan Kadar Methemoglobin a. Penetapan Oksihemoglobin 1. Diambil darah dengan spluit sebanyak 3 ml, kemudian 0,5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah diberi EDTA 1 tetes (whole blood). 2. Disiapkan tabung reaksi dan diisi aquadest sebanyak 20 ml. 3. Setelah itu, ditambahkan whole blood sebanyak 10 μl. 4. Lalu dituang ke dalam kuvet sebanyak 5 ml dan dibaca absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm dan nilai faktor 100. b. Penetapan Deoksihemoglobin 1. Diambil darah dengan spluit sebanyak 3 ml, kemudian 0,5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah diberi EDTA 1 tetes (whole blood). 2. Disiapkan tabung reaksi dan diisi aquadest sebanyak 20 ml. 3. Setelah itu, ditambahkan whole blood sebanyak 10 μl. 4. Lalu dituang ke dalam kuvet sebanyak 5 ml dan ditambahkan Na nitrit sebanyak 2 tetes sampai berwarna cokat.

53

5. Setelah itu dibaca absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm dan nilai faktor 100. c. Pengamatan Hasil Kadar methemoglobin =

(absorbansi

Oksihemoglobin

–

absorbansi

Deoksihemoglobin) x 100%

4.7.8. Penguburan Tikus Percobaan Tikus yang telah diambil organ yang akan diteliti dipastikan mati, bangkai tikus diletakkan dalam wadah baskom. Bangkai tikus percobaan dikubur di tanah dengan kedalaman minimal 50 cm dan luas luabang 0,25 m 2. Setiap lubang hanya digunakan untuk mengubur 10 tikus secara bersama, hal ini untuk mencegah bangkai tikus digali oleh hewan lain seperti kucing. Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari bangkai tikus tersebut (Sylvestris et al, 2012). 4.7.9. Analisis Data Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis dengan menggunakan uji ANOVA, uji Tukey, uji korelasi dan analisis regresi linier yang pengolahannya menggunakan SPSS 17. 1. Uji normalitas yang bertujuan untuk mengetahui kenormalan data (data bersifat normal jika signifikansi > 0,05). 2. Uji homogenitas untuk mengetahui apakah sampel penelitian berasal dari suatu populasi dengan varian yang sama (data dikatakan homogen jika nilai signifikansi > 0,05). 3. Oneway ANOVA, yaitu untuk menguji hipotesis kesamaan rata-rata antar kelompok ( >2 kelompok), apakah rata-rata antar sampel berbeda secara signifikan atau tidak. Dengan tingkat kepercayaan α = 0,05, dimana apabila diperoleh α > 0,05 artinya tidak ada perbedaan yang bermakna dan sebaliknya apabila diperoleh α < 0,05 menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna.

54

4. Uji Tukey 5% merupakan uji kelanjutan dari uji ANOVA, digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan dalam penelitian. 5. Uji korelasi digunakan untuk mengetahui hubungan yang signifikan antara dosis ekstrak biji buah anggur merah dengan perlakuan. 6. Analisis regresi linier untuk mengetahui seberapa kuat hubungan antara dosis ekstrak biji buah anggur merah dengan kadar methemoglobin.