Cromatografia De Exclusion Molecular 3o102e

Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Escuela de Química Biológica Depto. Bioquímica Laboratorio Bioquímica I, 2010

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Documento de Apoyo

La cromatografía es un método muy empleado para la separación, identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan poderoso, ni tiene tantas aplicaciones como la cromatografía. Los diversos métodos cromatográficos tienen en común el empleo de una fase estacionaria y una fase móvil. Los componentes de una mezcla se pasan a través de una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil y las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil. Los métodos cromatográficos son de dos tipos fundamentales. En la cromatografía en columna la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase móvil se hace pasar por el tubo, con presión y por gravedad. En la cromatografía plana la fase estacionaria esta sujeta por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o por la influencia de la gravedad. Los métodos de cromatografía en columna se clasifican de acuerdo con la naturaleza de la fase móvil, específicamente, líquidos, gases y fluidos supercríticos. La elución es un proceso en el cual se limpian los solutos a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil. Esta ultima, que se encuentra en la columna, se conoce como el eluyente.

VELOCIDADES RELATIVAS DE MIGRACION DE LOS SOLUTOS La eficiencia de una columna cromatográfica para separar dos solutos depende, en parte, de las velocidades relativas a las cuales se eluyen dos especies. Estas velocidades están determinadas por la relación de la concentración del soluto en cada una de las dos fases. Constantes de distribución. Todas las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias de la cantidad de la distribución del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. En cromatografía, la constante de distribución para un soluto es igual a la relación de su concentración analítica molar en la fase estacionaria y su concentración analítica molar en la fase móvil.

Tiempo muerto. Es el tiempo que se requiera para que una especie no retenida pase a través de una columna. Este tiempo proporciona una medida de la velocidad promedio de migración de la fase móvil y es un parámetro importante para la identificación de los analitos. Con frecuencia, la muestra o la fase móvil contienen una especie no retenida. Tiempo de retención. Es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición del soluto. Factor de retención, k. Es un parámetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de migración de solutos en columnas. De manera ideal los factores de retención para los analitos de una muestra deben estar entre 1 y 5. Factor de selectividad α. Para los solutos A y B se define como la relación de la constante de distribución del soluto retenido con mas fuerza, B y la constante de distribución del soluto retenido con menos fuerza, A. De acuerdo con esta definición, α siempre es mayor que la unidad.

COMATROGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR La purificación de una sustancia de interés se hace siguiendo los criterios de separación basados en alguna propiedad física o química que diferencia al compuesto en cuestión de otros que en principio estarían ligados a él. La cromatografía de filtración en gel, más corrientemente llamada de exclusión molecular, es una técnica de purificación muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas complejas de macromoléculas. Esta técnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analíticos (por ejemplo, para la determinación de pesos moleculares). Se definen los siguientes parámetros: -

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Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel, como los valores extremos (Máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. Volumen de elución, es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna. Volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.

Principio. Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional.

El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio (Fig. 1) quedando listo para su uso.

En el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirse varios volúmenes (Fig. 2): -

El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. El volumen de matriz (Vg) El volumen de vacío (Vo), o el volumen de agua existente entre las esferas del gel (fuera de ellas). El volumen ocupado por el agua en las esferas del gel (Vi), que se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo-Vg.

Cuando una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se hace pasar a través de la columna de gel, se produce la separación en virtud del siguiente principio: -

Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt).

Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. El resto de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionadamente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo. Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna (Fig.3). Teniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tamaño está, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesadas.

Fig.3

Grados de los Geles Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Las sustancias de peso molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas sino que se extraen conjuntamente con el volumen vacío (Vo), las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total (Vt), las más pequeñas que dicho rango. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua de cada gel, se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamaño de sus poros. Éste viene expresado por dos números que representan pesos moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular máximo de una sustancia que difunda perfectamente a través de todos los poros del gel, y el mayor, al peso molecular mínimo que ha de tener una sustancia para que pueda ser excluida de las esferas del gel multiplicado por 10. En el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy diversos (desde 1.0005.000, hasta 10.000-4.000.000), lo que posibilita la separación a diferentes escalas de pesos moleculares. Tabla No.1: Propiedades de algunos geles.

Factores que influyen en la separación Además de la diferencia intrínseca de tamaño existente entre las moléculas que van a ser cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una correcta separación de las mismas: -

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Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño aumenta con la longitud de la columna. Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1. El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeño comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado homogéneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Caracterización del comportamiento cromatográfico de un soluto Los resultados de la cromatografía de filtración en gel se expresan habitualmente en forma de gráficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en función del volumen de líquido extraído de la columna (Fig. 3).

Se pueden utilizar varios parámetros para caracterizar el comportamiento cromatográfico de una sustancia: -

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Volumen de elución (Ve). Se define como el volumen de líquido necesario para extraer una determinada sustancia. Presenta el inconveniente de depender fuertemente del volumen total de la columna. El Ve de una sustancia varía entre Vt y Vo. Coeficiente de distribución (Kd). Es el parámetro más correcto y también el más ampliamente utilizado. Indica la fracción del volumen interior accesible a un compuesto específico. El Kd de una sustancia se define como: Kd = Ve-Vo/Vt-Vo

El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fracción de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamaño. Además, el coeficiente de distribución está relacionado con el logaritmo del peso molecular de un soluto, a partir de su Kd, cromatografiando por filtración varios patrones de peso molecular conocido.