Enzimas Que Modificam O Dna 4p151q

Departamento de Química e Bioquímica Biologia Molecular 2013/2014

Enzimas que modificam o DNA Ana Carolina Cordeiro Rebeca Crespo Fiadeiro Docente: Margarida Amaral

Enzimas que modificam o DNA • • • • •

Nucleases Polimerases Ligases Nucleótido Transferases Enzimas que adicionam/removem grupos químicos – Metilases – Cinases – Fosfatases

Nucleases • Clivagem de ligações fosfodiéster entre nucleótidos Exonucleases

Endonucleases

Nucleases • Clivagem de ligações fosfodiéster entre nucleótidos Exonucleases Exonuclease III (E.Coli)

Bal31 (Alteromonas espejiana)

Nucleases • Clivagem de ligações fosfodiéster entre nucleótidos DNase I (pancrease da vaca)

Endonucleases

S1 Nuclease (Aspergillus oryzae)

Endonuclease de restrição

Nucleases – Engenharia Genética Zinc Finger Nuclease

Cys2His2 zinc finger

Proteína Zif268 constituído por 3 zinc fingers ligado ao DNA

Nucleases – Engenharia Genética Zinc Finger Nuclease Correcção genética por Recombinação homóloga mediada – terapia para doenças monogénicas

3 zinc fingers – reconhecimento

Fok1 (enzima de restrição) - clivagem

Polimerases • Síntese de nova cadeia complementar a uma cadeia de DNA molde

Polimerases Polimerase I (E.Coli) – Completa – 5’  3’ polimerase – 3’  5’ exonuclease (correcção de erros) – 5’  3’ exonuclease (nick translation) Cadeia líder

Cadeia atrasada

Polimerases Polimerase I (E.Coli) – Completa – 5’  3’ polimerase – 3’  5’ exonuclease (correcção de erros) – 5’  3’ exonuclease (nick translation)

Polimerases Polimerase I (E.Coli) – Completa – 5’  3’ polimerase – 3’  5’ exonuclease (correcção de erros) – 5’  3’ exonuclease (nick translation) Remoção do RNA primer

Preenchimento de nicks

Polimerases – Engenharia Genética Sequenciação do DNA Fragmento Klenow – 5’  3’ polimerase – 3’  5’ exonuclease (correcção de erros) – 5’  3’ exonuclease (nick translation)

Polimerases – Engenharia Genética Sequenciação do DNA 1. Clonagem do ssDNA a sequenciar no vector M13 2. Inserção do primer para permitir a ligação do DNA polimerase 3. Mistura reaccional: vector M13 + polimerase + 4 desoxinucleótidos + 1 didesoxinucleótido 4. Síntese de cadeias complementares

Polimerases – Engenharia Genética Sequenciação do DNA 5. Electroforese 6. Leitura

Polimerases – Engenharia Genética Sequenciação do DNA Escolha do Polimerase: Polimerase I : Actividade exonuclease 5’  3’ Actividade exonuclease 3’ 5’ Fragmento Klenow : Actividade exonuclease 3’  5’ Baixa eficiência (250bp) Sequenase : não contem actividade nuclease (Bacteriófago T7)

Polimerases – Engenharia Genética PCR e Thermal Cycle Sequencing Taq polimerase (Thermus Aquaticus): Enzima termostável – não sofre desnaturação a elevadas temperaturas PCR: Requer elevadas temperaturas para desnaturar o DNA – 94◦C Thermal Cycle Sequencing: Necessidade de amplificação de um gene  método que une PCR com sequenciação do DNA

Polimerases – Engenharia Genética Clonagem de cDNA Transcriptase Reversa (replicação dos virus de RNA): Problema: mRNA não pode ser inserido num vector Solução: Conversão de mRNA a DNA por síntese de cDNA 1. Inserção do primer para permitir a ligação do Transcriptase Reversa 2. Síntese da cadeia de cDNA (molécula híbrida) 3. Degradação do RNA por um RNase H  fragmentos de RNA servem de primers para o DNA polimerase I

Polimerases – Engenharia Genética Clonagem de cDNA 4. Síntese da cadeia complementar do cDNA resultando num dsDNA 5. Inserção da molecula dsDNA no vector 6. Clonagem

Ligases • Formação de ligações fosfodiéster entre nucleótidos Reparação de descontinuidades

Junção de duas moléculas DNA

Ligases – Engenharia Genética DNA recombinante Ligase: Responsável pela junção do vector e o DNA a clonar

DNA ligase utilizado em engenharia genética: E.coli infectado com fago T4 Mecanismo de acção do ligase

Ligases – Engenharia Genética DNA recombinante Blunt ends vs. Sticky ends

Ligases – Engenharia Genética DNA recombinante Síntese de Sticky ends 1. Linkers

Ligases – Engenharia Genética DNA recombinante Síntese de Sticky ends 2. Adaptadores

solução

Nucleótido Transferases • Adição de desoxirribonucleótidos ao terminal 3’-OH (extremidade ou nick)

Nucleótido Transferases – Engenharia Genética DNA recombinante Síntese de Sticky ends 3. Cauda de homopolímeros

Nucleótido Transferases – Engenharia Genética TUNEL

• TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) : método para detectar fragmentação de DNA por apoptose

Célula apoptótica marcada com TUNEL

Adição/Remoção de Grupos DNA Cinase DNA Fosfatase

• PNKP (polynucleotide kinase/phophatase) é essencial à reparação de DNA danificificado por ROS. • Proximidade do mtDNA à cadeia respiratória e cadeia transportadora de e-  mutações no mtDNA  Diabetes, Cancro, Doenças neurodegenerativas, envelhecimento

Adição/Remoção de Grupos – Engenharia Genética DNA recombinante • Tratamento de vectores para não reciclizar sem inserção do gene a clonar

Adição/Remoção de Grupos DNA Metiltransferases

• Metilação em local específico

Me

C–G

• Modificação epigenética essencial • Alvos: – Promotores de genes : inactivação – DNA satélite : estabilização de centrómeros

Metilases de Grupos Adição/Remoção

eComoDNA as regiões não metiladas são mantidas? Metiltransferases Desmetilação

:

1

Se uma região do DNA não foi metilada, uma proteína específica reconhecerá as sequências não metiladas protege-a contra a metilação.

ssim que um local é metilado existem duas formas para o desmetilar:

2

• Bloquear a metilase de manutenção, proibindo-a de actuar no local aquando da replicação; • Desmetilar o local, removendo o grupo metil directamente da citosina ou extraíndo a citosina metilada;

Adição/Remoção de Grupos – Engenharia Genética Bisulfite sequencing + Footprinting Estudo do posicionamento nucleossomal utilizando DNA metiltransferases 1. Amplificação do promotor p16 por PCR 2. Tratamento de naked DNA (sem nucleossomas) com metiltransferase SssI (M.SssI) – Metilação de locais G 3. Tratamento de núcleos com M.SssI – Metilação apenas em locais íveis (sem nucleossomas) 4. Tratamento das duas linhas celulares com Bisulfite -bisulfite sequencing 5. Electroforese em gel - Footprinting

nucleossoma

Adição/Remoção de Grupos – Engenharia Genética Gene Silencing • Baixa [s-adenosilmetionina]  Diminuição da metilação de promotores da expressão do gene da Amiloide β  Sobrexpressão do gene  Acumulação de Amiloide β  Alzheimer • Tratamento: istração de s-adenosylmetionina

Bibliografia • • • • • •

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