Protocolo Meio Lb Sólido Autoclave 2c2h4i

MEIO LB SÓLIDO Para cada 1000 mL de meio, pese: -

Peptona .......................................................... 10g NaCl ................................................................ 10g Extrato de Levedura ....................................... 5g Ágar ................................................................ 20g pH 7,2

PREPARO: 1. Pese cada componente individualmente em um Becker pequeno de plástico que se encontram no armário de vidrarias, lembre-se de lavar e secar a espátula a cada pesagem; 2. Após ter todos eles pesados, adicione um pouco de água destilada (cerca de 500~600mL) em um Erlenmeyer de 2000mL e coloque a Peptona, NaCl e Extrato de Levedura. O ÁGAR DEVE SER O ÚLTIMO COMPONENTE A SER ADICIONADO; 3. Coloque o Erlenmeyer em um agitador magnético até homogeneizar a solução; 4. Assim que estiver homogênea, transfira para uma proveta de 1000mL e complete até chegar a 1000mL; 5. Após completar o volume na proveta, volte o meio para o Erlenmeyer e então adicione o ágar, com cuidado para não grudar na parede do vidro; 6. Embale o Erlenmeyer com boneca, jornal e barbante e leve para ser esterilizado na autoclave por 15 minutos (mínimo). OBS: Para levar na autoclave sempre colocar em um frasco com o dobro da capacidade de meio que se está fazendo, se não tiver um Erlenmeyer de 2000mL, após acertar o volume na proveta, dividir 500mL para dois Erlenmeyers de 1000mL. OBS 2: Se não tiver um Erlenmeyer usar um balão de fundo chato.

AUTOCLAVE 1. Antes de usar a autoclave, VERIFIQUE O NÍVEL DE ÁGUA. Caso estiver abaixo do X de metal (e da cesta), complete com ÁGUA FILTRADA; 2. Ligue a autoclave no máximo e deixe ligada até pré-aquecer, feche a tampa sem rosquear, espere até a autoclave ficar quente; 3. Prepare todo o material que irá ser esterilizado colocando boneca, embrulhando em jornal e fechando com barbante depois coloque-os na cesta da autoclave; 4. Coloque a cesta dentro da autoclave, feche a tampa rosqueando os pinos contrários com a mesma força e após fechar todos verificar se a válvula está aberta; 5. Esperar até começar a sair vapor da válvula, feche a válvula e espere a pressão chegar no 121; 6. Quando ela atingir o 121 diminua a temperatura para médio e aguarde 15 minutos para materiais limpos (não contaminados) e 20 minutos ou mais para material sujo (contaminados)

7. Após ar o tempo indicado, desligue a autoclave e espere cerca de 20minutos para a pressão abaixar. Retire o material com cuidado utilizando uma luva. OBS: Qualquer líquido (meios, soluções, etc) devem estar em frascos com o DOBRO DO VOLUME para evitar que o líquido vaze ao aquecer.

CONTAGEM DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA 1.

Prepare placas de Petri contendo meio sólido, deixe-as secar no fluxo laminar com a luz U.V. ligada até os meios solidificarem; 2. Ligue o bico de Bunsen e flambe uma alça de Drigalski, trabalhe sempre ao redor do bico de Bunsen; 3. Adicione 100µL da diluição correspondente a placa no centro da placa e espalhe com a alça de Drigalski até sentir que a alça está “colando” no meio; 4. Após terminar de inocular cada diluição em duas placas, coloque-as na estufa por 24h e no dia seguinte faça a contagem de colônias.

DILUIÇÃO SERIADA Para fazer uma diluição seriada começa-se com a diluição de 10 -1. 1. Prepare todos os tubos necessários, para cada amostra faça 1 tubo contendo 9mL de solução salina e tubos com 4,5 mL (a quantidade depende até que número vai sua diluição); 2. Em um tubo com 9 mL de solução salina ou outra solução de diluição qualquer, adicione 1g ou 1ml do seu inóculo e agite no vórtex. 1g ou 1 mL de inóculo

9 mL de solução salina

10-1

3. Do tubo da diluição 10-1 (1:10) pegue 500µL e e para um tubo com 4,5 mL de solução salina, depois agite no vórtex, fazendo a diluição 10 -2. OBS: Pode-se ar 1ml para um tubo com 9mL também, mas fazendo com 4,5 mL economiza-se solução salina. 4. Do tubo 10-2 e 500µL para outro tubo com 4,5mL de salina, e no vórtex e está feita a diluição de 10-3. 5. Faça o mesmo procedimento até chegar na diluição desejada. 500µL

500µL

500µL

... 10-1

10-2

10-3

10-4