Informe 5 Técnicas Histológicas 1p6p51

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO INFORME DE LA PRÁCTICA N.- 5

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

DOCENTE: Lcdo. IVÁN PEÑAFIEL MÉNDEZ

TERCER SEMESTRE

ELABORADO POR: NELSON JAVIER CHAGNAMA

FECHA DE LA PRÁCTICA: 15 - 07 - 2016 FECHA DE ENTREGA: 03 - 08 - 2016 DURACIÓN DE LA PRÁCTICA: 3 HORAS: De 17:00 a 20:00

PERIODO ACADÉMICO: Abril 2016 - Agosto 2016

TÍTULO DE LA UNIDAD:  Unidad 3: TINCION Y MONTAJE.

TEMA DE LA PRÁCTICA: 

TINCION HEMATOXILINA – EOSINA Y MEDIO DE MONTAJE DE LOS LAMINILLAS IMPREGNADAS CON TEJIDOS.

OBJETIVOS:

OBJETIVO GENERAL: 

Realizar una correcta tinción y montaje de las laminillas que están con un tejido impregnado en ella.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Preparar la batería de tinción con los reactivos y sustancias necesarias en Eosina y Hematoxilina. Observar los diferentes procedimientos para una correcta tinción histoquímica. Realizar el montaje de laminillas para la preservación de un material histológico. Conocer las diferentes técnicas de montaje Reparar las laminillas rotas de un modo adecuado y específico.

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA O MARCO TEÓRICO:

TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA

La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es el método de tinción de rutina utilizado en histología y medicina diagnóstica. El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilos) en tonos azul y púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidó filos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

HEMATOXILINA Es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum , conocida también con el nombre de palo de Campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hemateínaDe carácter catiónico o básica, por lo que tiñe estructuras ácidas (basófilos) en tonos azul y púrpura. Se utiliza en histología para teñir los componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que da una coloración violeta. Tiñe intensamente los núcleos de las células, dado que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos. Tal como se obtiene de la planta e incluso luego de sufrir el proceso de oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe combinarse con iones metálicos, especialmente las sales de hierro (III) o aluminio (II), que actúan como mordientes.

Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos. Actúa como un colorante BÁSICO que se asocia y tiñe componentes ÁCIDOS de la célula como estructuras aniónicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o carboxilos ionizados):    

Heterocromatina y nucléolos ARN ribosomal Matriz extracelular Color: azul o violeta

EOSINA Es un colorante basófilo (afinidad con lo básico, porque es acida), en forma de polvo rojo cristalino, de uso ampliamente extendido en el ámbito industrial, desde la industria textil hasta el estudio biológico e histológico. Como curiosidad, también se utiliza en la coloración de la gasolina. La eosina es un compuesto ácido cuya propiedad está basada en su polaridad negativa, lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva. Por ello colorea componentes y orgánulos citoplasmáticos, colágeno y obras musculares, pero no los núcleos (que son básicamente ácidos nucleicos y están cargados negativamente). Aquellos componentes que se tiñen con eosina son conocidos como acidófilos o eosinófilos. La coloración resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos. Es fuertemente fluorescente, aunque esta característica es muy poco utilizada. La eosina es un colorante muy usado en tinciones de vitalidad. Al ser un colorante aniónico (carga negativa) no penetra en el interior celular a no ser que la membrana sea permeable. Esto solo sucede en células muertas. Por tanto, en una tinción con eosina encontraremos células con el interior teñido (muertas) y células solo teñidas en su entorno (vivas).

Colorante ÁCIDO (predomina densidad de carga negativa), que se asocia y colorea estructuras catiónicas (componentes BASICOS) del citoplasma y matriz extracelular  Filamentos citoplasmáticos.  Componentes membranosos intracelulares.  Fibras extracelulares (por sus aminoácidos básicos ionizados).  Color: rosado Actualmente existen dos compuestos conocidos como eosina y que están íntimamente relacionados:  Eosina Y (C20H8Br4O5, tetrabromofluoresceína, CI 45380, CI 45386), comúnmente conocida como eosina amarilla, y  Eosina B (C20H8Br2N2O9, dibromodinitrofluoresceína, CI 45400), también conocida como eritrosina B azulada. Ambas, en principio, son intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellas en el resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra suele seguir un criterio subjetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la más utilizada en procedimientos rutinarios histológicos, como tinción de contraste en la técnica de la Hematoxilina Eosina, y su preparación alcohólica es un paso obligado en la Técnica de Papanicolaou.

Protocolo: 1) Previamente tendremos que elaborar un filtro para la hematoxilina. 2) Desparafinar las muestras. Este paso se realiza en dos tandas: la primera en la estufa 60ºC durante 10 min y posteriormente

líquido

intermedio,

Xilol,

tres

baños

de

10

min

cada

uno.

Asegurarse durante todo el proceso que los diferentes reactivos cubran por completo las muestras de no ser así, agitar el cestillo con las muestras de forma vertical, de arriba a abajo.

Una vez finalizado este paso, no olvidar escurrir el cestillo en papel empapante con la intención de evitar contaminar los diferentes reactivos.

Estufa.

Muestras en la estiua a 60ºC 3) Hidratar con una batería de alcoholes a concentraciones decrecientes (de 100% al 50%) tres minutos por cada coplón de alcohol. Ir observando la superficie del cristal.

Un par de coplins de alcoholes. 4) Agua, en nuestro caso la utilizamos del grifo ya que el agua de Valencia es rica en calcio. En este paso es imprescindible prestar atención a la superficie del cristal. Agitar enérgicamente el cestillo hasta que en esta no se encuentre uniforme. 5) Hematoxilina, tiempo estimado de 3-5 min.

Unos segundos antes de que finalice el tiempo tendremos que transportar el coplin con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro coplin y rellenaremos este de agua del grifo a chorro constante hasta que el agua salga transparente.

Hematoxilina en la pila con el chorro de agua cayendo. Tener la precaución de evitar que el chorro de agua no incida directamente en las muestras, ya que esto podría dañar las muestras.

El chorro a un lado sin dañar las muestras

Añadir agua hasta que salga transparente. Una vez el agua del coplin se aprecie transparente se trasladará de nuevo a la mesa de tinción para continuar con el protocolo. 6) Diferenciación con ácido clorhídrico.

En este caso, la estancia de las muestras en el reactivo será muy rápida. 7) Neutralización con bicarbonato. Debido a nuestra localización geográfica, en nuestro laboratorio utilizamos agua del grifo. 8) Eosina, de 30 segundos a 3 min. 9) Lavar en agua corriente. Este proceso también será con la mayor rapidez posible, de lo contrario se podría perder el color. 10) Deshidratación a concentraciones crecientes de alcohol (del 50% al 100%). Desde los 50-96% las muestras estarán en o con el líquido una vez durante 30 segundos, mientras que al 100% se dejarán reposar las muestras en tres coplins diferentes durante 10 min cada uno. 11) Líquidos intermedios, Xilol. Tres coplins diferentes y cinco min por coplin. 12) Para finalizar montaremos las muestras con líquido de montaje Eukitt.

Líquido de montaje.

Muestras recién montadas.

MONTAJE DE LAS LAMINILLAS El paso final en la preparación de una lámina portaobjetos es el de cubrir la porción que contiene el tejido con un cubreobjetos. Esto hace que la lámina sea permanente y permite el examen microspico. Para pegar la laminilla hay tres medios de montaje que se pueden usar: resanas naturales (bálsamo de Canadá), resinas sintéticas (usadas en la actualidad) y medios acuosos (estos últimos se usan en estructuras alteradas por la deshidratación o de medios basados en xileno como tinciones para lípidos). MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS: MUESTRA: Placas porta objetos Placas cubreobjetos de 24x50 mm Resina Papel absorvente Pipeta pasteur MUESTRA: Tejidos impregnados a la laminilla.

PROCEDIMIENTO: Observar la laminilla y aplicar las técnicas indicadas para cada procedimiento TECNICA DE MONTAJE: Colocar 3 gotas de entelan en la placa Ubicar la palca con el cubreobjetos y colocar correctamente para evitar burbujas

TECNICA DE REPARACION DE LAMINILLAS Recoger todos los pedazos de las laminillas Todos los pedazos que están implicadas a dicha laminillas Colocar resina en un portaobjetos Unir los pedazos en la placa con resina e ir pegando Colocar más resina y poner encima un cubreobjetos. OBSERVACIONES: La colocación de la resina resulto un poco difícil La reparación de las laminillas fue muy complicada ya que los pedazos eran muy diminutos y no había como encajarlos. CONCLUSIONES: 

Las técnicas de montaje y tinción son muy importantes para el procesamiento y preservación de tejidos.



Existen varias técnicas



Para la realización de dichos procesos pero se le aplica lo indicado por el docente.



La reparación de las laminillas es de vital importancia para la salud de un paciente ya que si no se lo hace podría perjudicar la salud de un paciente por la medida del tejido que pudo ser patológico.

RECOMENDACIONES: Utilizar todo el equipo de protección para evitar derrames de los reactivos o algún otro accidente. Realizar de una manera correcta los protocolos a seguir, para deben tener los conocimientos necesarios y de den estar bien capacitados para realizar esos procesos. SITIOS WEB: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_hematoxilina-eosina http://procesamientohistologicoldl.blogspot.com/2015/05/protocolo-de-tinciones-ihematoxilina.html http://es.slideshare.net/RosiVallejo/coloraciom-hematoxilina-eosina-y-medios-de-montaje http://hematoxilina-eosina-uc.blogspot.com/