5 Extracción De Adn Bacteriano 1k402r

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular UNIVERSIDAD DEL CAUCA

Guía No. 2

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO

INTRODUCCIÓN Cuando los científicos comprendieron la estructura de la molécula de ADN y como la información que lleva se traduce en funciones y características, comenzaron a diseñar técnicas de laboratorio para aislarlo, analizarlo, modificarlo y hasta transferirlo de un organismo a otro. Actualmente existen numerosos protocolos para extraer ADN a partir de muestras de diferentes organismos vivos, ya sean vegetales, animales o microorganismos, siendo el objetivo principal obtener una preparación de ADN de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la posibilidad de almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su estructura y propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la reproducibilidad en experimentos posteriores. La cantidad es un concepto relativo que depende, del número y estado de las células propias del tejido a estudiar. Por lo tanto, como regla general, un buen método de extracción debe mantener la integridad física y bioquímica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y concentración (Sambrook et al. 2001). Los protocolos de extracción de ADN emplean métodos físicos, químicos y mecánicos que involucran básicamente tres pasos: 1. Lisis celular 2. Eliminación de proteínas 3. Precipitación y limpieza del ADN. Es muy importante tener en cuenta que el trabajo de biología molecular requiere de una serie de precauciones para no contaminar las muestras con ácidos nucleicos extraños. Es necesario limpiar las áreas de trabajo con solventes como el ácido clorhídrico (10%), sosa (NaOH, 0.5 N) y/o etanol (70%). También hay que utilizar guantes para protección personal y para evitar contaminar las muestras, así como trabajar con materiales y soluciones estériles. Se recomienda trabajar en una campana de flujo laminar y si es posible, someter el material a radiación ultravioleta de 5 a 10 minutos para degradar cualquier ácido nucleico presente. OBJETIVO

Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y cantidad.

MATERIALES

Juego de micropipetas (2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul ) Baño de María Agitador Recipiente para hielo Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm Congelador (-20°C) Tubos ependorff de 1,5ml Guantes de látex Toallas de papel

Cantidad 1 1 1 1 1 1 5 1

REACTIVOS Tris-HCL 1M pH8,0 EDTA 0,5M pH8,0 SDS 10 % NaCl 5M Acetato de sodio 3M pH 5,2 Etanol grado biología molecular Buffer TE RNasa Proteinasa K

Cantidad 100 mL 50 mL 50 mL 50 mL 100 mL 50 mL 50 mL

PROCEDIMIENTO 1. Obtener un cultivo de bacterias Escherichia coli de 18 horas de incubación en caldo nutritivo. 2. En un microtubo agregar 1.5 ml del cultivo bacteriano con ayuda de una micropipeta. 3. Centrifugar a 12000 rpm por 3 minutos 4. Eliminar el sobrenadante perfectamente escurriendo las muestras en papel secante. 5. Resuspender en 200 µl de buffer de lisis (40 mM de Tris-HCl pH 7,8, 20 mM de acetato de sodio, 1mM de EDTA y 1 % de SDS). 6. Pipetear vigorosamente. 7. Opcional: para inactivar proteínas adicionar 5% v/v de β-mercaptoetanol ó 50–100 µg/mL de Proteinasa K. 8. Para remover proteínas y desechos celulares, adicionar 66 µl de NaCl 5 M y mezclar.

9. Centrifugar a 12000 rpm por 10 min a 4 °C. 10.Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y adicionar un volumen igual de cloroformo. 11.Invertir manualmente 50 veces, hasta que se forme una solución lechosa. 12.Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min. 13.Repetir la extracción con cloroformo 14.Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 µl), sin tocar el botón y transferir a un tubo nuevo. 15.Adicionar 300 µl de etanol absoluto frío (a -20° C). 16.Incubar a -20º C durante 30 min. 17.Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min. 18.Eliminar perfectamente el sobrenadante. 19.Limpiar el botón con 300 µl de etanol al 70% agitando brevemente en vórtex. 20.Centrifugar a 12000 rpm por 3 min. 21.Eliminar perfectamente el sobrenadante. 22.Secar perfectamente el botón a 65° C por 5 min. 23.Resuspender en 50 a 100µl de agua pura, desionizada y estéril ó buffer TE (Tris 10 mM – EDTA 1 mM). El ADN que ha sido extraído de un tejido debe ser cuantificado y su calidad verificada. El método más empleado para la determinación simultánea de estas características es la electroforesis en gel de agarosa. La cuantificación también se puede realizar empleando un espectrofotómetro, el cual detecta la radiación emitida por las bases nitrogenadas presentes en el ADN luego de ser excitadas con luz de 260 nm. De igual manera se puede emplear un fluorómetro, el cual cuantifica la emisión de energía de los compuestos químicos (fluorocromos) que se intercalan dentro del ADN. BIBLIOGRAFÍA Rocha-Salavarrieta P. (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de aceite. Palmas Vol. 23(3): 9-17. Sambrook, J. and D. Russell. 2001. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.