Separación E Identificación De Aminoácidos De Jugos De Frutos 154b29

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ANTECEDENTES La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswett. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de cromatografía de capa fina. Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de capa fina, estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a esta técnica simple, económica y eficiente. FUNDAMENTO La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla que permite: ‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. ‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. ‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. El fundamento de la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un carácter más apolar, tendrán tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras que los aminoácidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma, usa la cromatografía bidimensional. Basada en el principio anterior, con la diferencia en la técnica, la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90° y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 1

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de solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla de componentes. Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo‐dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan. Tras la eliminación del disolvente, se determina la posición de los componentes con un reactivo de revelado (ninhidrina), y se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Rf = Frente o distancia del soluto Frente o distancia del disolvente

OBJETIVO Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 2

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  

Separar los aminoácidos presentes en el jugo del jitomate por cromatografía bidimensional en capa fina. Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminoácidos. Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional, con el de la unidimensional.

RESULTADOS: En cada placa cromatografía se observan manchas de diferentes tamaños correspondientes a cada uno de los aminoácidos y a diferentes distancias. De acuerdo a la relación de migración para las sustancias aquí utilizadas se obtuvieron los siguientes valores de Rf para cada una de ellas.

Figura 1: Cromatograma 1 Unidimensional. Fase móvil: cloroformo-metanol-amoniaco, de izquierda a derecha. Aminoácidos: Arginina, Lisina, Glutamina, Histidina, Glicina, Prolina, Metionina, Fenilalanina, Triptofano, Tirosina.

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Figura 2: Cromatograma 2 Unidimensional. Fase móvil: Butanol-ácido acético-agua, de izquierda a derecha. Aminoácidos: Arginina, Lisina, Glutamina, Histidina, Glicina, Prolina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano, Tirosina.

II Fase Móvil

I Fase

Figura 3: Cromatograma 3 Bidimensional de aminoácidos tipo. Fase móvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase móvil II: butanol-ácido acético-agua.

II Fase Móvil

Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 4 I Fase

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Figura 4: Cromatograma 4 Bidimensional del jugo de jitomate. Fase móvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase móvil II: butanol-ácido acético-agua.

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles. 1ª. Fase Cromatograma 1

Móvil

Aminoácido

2ª Fase Móvil Cromatograma 2

Frent e del solut o

Frente del disolvente

Rf

Frente del soluto

Frente del disolvent e

Rf

Arginina (Arg)

1.5

7.8

0.1923

1.4

7.9

0.1772

Lisina (Lys)

2.4

7.8

0.3076

1.2

7.9

0.1518

Glutamina (Glu)

2.8

7.8

0.3846

3.3

7.9

0.4177

Glicina (Gly)

3.8

7.8

0.4871

2.6

7.9

0.3291

Prolina (Pro)

4.3

7.8

0.5512

2.7

7.9

0.3417

Triptófano (Thr)

4.5

7.8

0.5769

3.2

7.9

0.4050

Histidina (His)

4.8

7.8

0.6153

1.5

7.9

0.1898

Tirosina (Tyr)

5.1

7.8

0.6538

4.7

7.9

0.5949

Metionina (Met)

6.4

7.8

0.8205

4.8

7.9

0.6075

Fenilalanina (Phe)

6.8

7.8

0.8717

5.3

7.9

0.6708

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Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.

Aminoácido

1ª. Fase Cromatograma 3

Móvil

2ª Fase Cromatograma 3

Móvil

Frent e del solut o

Frente del disolvente

Rf

Frente del soluto

Frente del disolvent e

Rf

Lisina Lys

1.2

7.9

0.1518

1.0

7.8

0.1282

Arginina Arg

1.4

7.9

0.1772

1.3

7.8

0.1666

Histidina His

1.5

7.9

0.1898

1.6

7.8

0.2051

Glicina Gly

2.6

7.9

0.3291

2.0

7.8

0.2564

Prolina Pro

2.7

7.9

0.3417

2.5

7.8

0.3205

Triptófano Thr.

3.2

7.9

0.4050

2.8

7.8

0.3589

Gutamina Glu

3.3

7.9

0.4177

3.1

7.8

0.3974

Tirosina Tyr.

4.7

7.9

0.5949

4.7

7.8

0.6025

Metionina Met

4.8

7.9

0.6075

4.8

7.8

0.6153

Fenilalanina Phe.

5.3

7.9

0.6708

5.4

7.8

0.6923

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles.

Aminoácido

1ª. Fase Cromatograma 4 Frent e del solut

Frente del disolvente

Móvil

Rf

2ª Fase Cromatograma 4 Frente del

Frente del disolvent

Móvil

Rf

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o Lisina Lys Arginina Arg Histidina His Glicina Gly Triptófano Thr Glutamina Glu Torosina Tyr. Metionina Met. Fenilalanina Phe

soluto

e

1.0 1.3 1.6 2.0 2.5

7.8 7.8 7.8 7.8 7.8

0.1282 0.1666 0.2050 0.2564 0.3589

1.0 1.2 2.2 2.5 2.7

7.9 7.9 7.9 7.9 7.9

0.1265 0.1518 0.2784 0.3164 0.3417

2.8

7.8

0.3974

2.9

7.9

0.3670

3.1 4.7

7.8 7.8

0.6025 0.6153

3.1 3.8

7.9 7.9

0.3924 0.4810

4.8

7.8

0.6923

5.3

7.9

0.6708

Tabla 4. Cromatograma bidimensionales desarrollado en las 2 fases móviles.

Rf creciente en la 1ª fase móvil 0.1282 0.1666 0.2564 0.3589 0.3974 0.6923

Rf en la 2ª Fase móvil 0.1265 0.1518 0.2784 0.3670 0.3924 0.6708

problema

(IV)

Aminoácido correspondiente Lisina Lys Arginina Arg Glicina Gly Triptófano Thr Glutamina Glu Fenilalanina Phe

DISCUSIÓN: La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo, siempre requiere contar con un estándar de referencia; en este caso se tuvieron 10 Aminoácidos tipo (Arginina, Lisina, Glutamina, Glicina, Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 7

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Prolina, Triptófano, Histidina, Tirosina, Metionina, Fenilalanina) para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del estándar al ser revelada con agentes químicos, con los datos experimentales obtenidos. La mayoría de los aminoácidos pudo identificarse en cada una de las placas desarrolladas gracias al revelado que se hizo con una solución de ninhidrina; ya que esta reacciona debido a la presencia del grupo α–NH2, permitiendo el reconocimiento de los mismos por la coloración denominada púrpura de Ruhemann. Sin embargo, la prolina no tiene dicho grupo libre, sino –NH- (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) por lo que genera una mancha de color amarillo obscuro la cual se observo plenamente en la placa II y III. Al realizar los cálculos de Rf para determinar en específico cada uno de los aminoácidos encontrados en nuestra solución problema, ninguno de ellos presentó el mismo, ya que la tendencia de estos para asociarse con mayor fuerza a una u otra fase móvil (I: Cloroformo-metanol-amoniaco 17% (2:2:1), II: butanol-ácido acético-agua (3:1:1)), no es la misma por su naturaleza química; pero ello constituye una ventaja, puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más específicamente registrando sus Rf en varios disolventes.. Nuestros valores pueden considerarse satisfactorios; ya que de 10 aminoácidos tipo se identificaron 6 en el jugo de jitomate a partir de la comparación de la tabla 2 y 3. De los que no fue posible hacerlo se debe a las características tan similares que tienen los aminoácidos unos con otros, pues se aglutinaron en un sólo espacio. Incluso algunos factores que pudieron haber afectado al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentración del ambiente de la cámara y la temperatura; puesto que la fase móvil recorrió en un tiempo muy corto al esperado cada uno de los cromatogramas. Comparando la cromatografía unidimensional y bidimensional se destaca que la segunda fue más eficiente debido a que, la muestra se encuentran expuesta a 2 fases móviles, lo que quiere decir que tendrá 2 separaciones de acuerdo a las propiedades de cada fase, dando como resultado el incremento en el grado de separación de cada uno de los aminoácidos presentes en nuestra solución problema. CONCLUSIÓN: Se logró separar cada uno de los aminoácidos presentes en el jugo del jitomate por cromatografía bidimensional y debido a que cada uno de ellos presentes en la muestra tiene un Rf característico; se logro la identificación de: Lisina, Arginina, Glicina, Triptófano, Glutamina y Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 8

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Fenilalanina. PREGUNTAS EXTRAS: 1.- Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema. Compare con sus resultados y concluya. Nutriente Ácido aspártico Ácido glutámico Alanina Arginina Cistina Fenilalanina Glicina Hidroxiprolina **Histidina Isoleucina

Cantidad 113 mg. 314 mg. 24 mg. 17 mg. 0,93 mg. 22 mg. 17 mg. 0 mg. 12 mg. 21 g.

Nutriente Leucina Lisina **Metionina **Prolina Serina **Tirosina Treonina Triptófano Valina

Cantidad 28 mg. 27 mg. 7 mg. 15 mg. 26 mg. 11 mg. 21 mg. 6 mg. 21 mg.

Observando la tabla, se verifica que las concentraciones de los aminoácidos no encontrados en el jitomate son muy bajas **por lo cual no se logró su identificación en la cromatografía unidimensional en la práctica. ** Aminoácidos no identificados en la solución problema. 2.- Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.

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3.- ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Si es posible cambiar el orden, siempre y cuando realicemos la eliminación de la primera fase móvil con aire caliente para no causar problemas a la segunda; ya que la separación de los aminoácidos de jugo se da en cuanto a las polaridades de cada uno. 4.- Indique las posibles fuentes de error en esta técnica. -No usar guantes de látex para la preparación de las placas cromatograficas. -La temperatura de las cámaras. -El haber raspado la sílica de las placas cromatograficas. -No dispersar bien la ninhidrina en la placa resultando que no se revelen algunas separaciones. -Contaminación de los reactivos. -Marcar las placas con pluma o plumón. - Colocar mal los cromatogramas en la cámara.

BIBLIOGRAFÍA:

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