Laporan Tdl Mikro Andrew 4k1y1q

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM (TDL) MIKROBIOLOGI UJI HEMAGLUTINASI (HA) UJI HEMAGLUTINASI INHIBITION (HI) UJI ELISA

Oleh:

Makbruri NPM.

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA 2016 PRAKTIKUM 1

Uji Hem-Aglutinasi (HA) A. Waktu Pelaksanaan Selasa, 15 Maret 2016, Pukul 11.00 WIB B. Tujuan Tujuan praktikum ini untuk mengukur titer HA sediaan virus yang akan digunakan untuk uji Hambatan aglutinasi (HI).

C. Prinsip Beberapa virus manusia mempunyai kemampuan untuk berikatan dengan permukaan sel darah merah dari spesies berbeda. Adanya ikatan antara virus (antigen) dengan sel darah merah (eritrosit) akan menyebabkan terjadi hemaglutinasi.

Gambar 1: Reaksi Uji hemaglutinasi

D. Landasan teori Virus adalah suatu genom yang tertutup dalam selubung protektif. 1 Virus hanya mengandung salah satu asam nukleat saja (DNA atau RNA). Replikasi virus memerlukan asam nukleat saja. Virus memerlukan host untuk bias berkembang biak2. Pada luar hospes, virus terdapat sebagai partikel virus, yaitu virion. Virion terdiri dari, atas: asam nukleat dan selubung protein yang disebut kapsid. Partikel virus ini disebut nukleocapsid. Virus dapat merusak seluruh kompleks sel dan menimbulkan kerusakan jaringan, bercak-bercak nekrosis dan kepingan lisis. Umumnya hospes virus, yaitu: tumbuh-tumbuhan, hewan dan mikroorganisme.3 Uji Hemaglutinasi (HA) atau Hemaglutination Test (HA Test) terjadi pada virus yang memiliki hemaglutinin pada permukaan partikel virus, jika berikatan dengan reseptor khusus pada eritrosit. Hasil dari uji HA dapat diperoleh dengan cepat, hasil dari tes ini didasarkan ada/tidaknya ikatan hemaglutinasi eritrosit pada partikel virus (virion). Terkadang dalam uji HA, ikatan hemaglutinasi dapat dikacaukan oleh sifat elusi virus dikarenakan terdapat aktivitas enzim neuraminidase dari virus yang dapat merusak ikatan antara eritrosit dengan virus 4. Aktivitas hemaglutinasi dan neuraminidase diperankan oleh dua glikoprotein utama pada permukaan virus, yaitu: hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA)5. Gen Hemaglutinin (HA), adalah molekul glikoprotein selubung virus yang

berfungsi untuk meningkatkan virus ke reseptor sel target dan mengawali terjadinya infeksi. Gen neuraminidase (NA), adalah enzim yang dibutuhkan virus untuk melepas hasil replikasi virus dari sel yang infeksi.6 Hemaglutinasi, adalah daya pengikatan antigen virus dengan eritrosit hewan tertentu, karena virus diikat oleh reseptor eritrosit. Bila virus diikat oleh eritrosit beberapa jenis virus, dan dilepaskan kembali secara spontan oleh eritrosit yang mengikat virus sehingga terjadi elusi. Sesudah terjadi elusi, virus dilepaskan dan virus masih bisa mengadakan hemaglutinasi dengan eritrosit lain, tetapi eritrosit yang telah dilepaskan virus tidak bisa mengikat virus lain, sebab reseptor eritrosit sudah rusak oleh virus yang pertama. Hemaglutinasi terjadi dalam tiga tahap, yaitu: (1) absorpsi virus pada reseptor virus, (2) aglutinasi dari kompleks virus eritrosit, (3) dan elusi virus secara spontan.7 Titer virus dapat diketahui dengan melihat well terakhir pada mikroplate, pada pengenceran tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur.8 Uji HA digunakan untuk mengetahui titer awal antigen yang akan digunakan dalam uji hambatan hemaglutinasi (uji HI). Selain itu juga digunakan untuk re-titrasi antigen dengan tujuan memastikan titer antigen yang digunakan. 7 Titer hemaglutinasi HA, yaitu: pengenceran virus tertinggi yang dapat menyebabkan hemaglutinasi total, semakin tinggi pengenceran virus maka akan semakin kecil kekuatan virus untuk menyebabkan hemaglutinasi total.7 E. Alat dan bahan 1. Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu: i.

Mikroplate (96 well) dengan dasar V

ii.

Mikropipet 25μl dan 100μl.

iii.

Yellow tip

iv.

Timer/jam

v.

Wadah pembuangan

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah i.

Sel darah merah (SDM) ayam

ii.

Suspensi virus H1N1

iii.

Larutan PBS/Phospate Buffer Saline

F. Cara kerja 1. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan terlebih dahulu. 2. Menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) dengan lengkap dan benar. 3. Ditambahkan 50μl larutan PBS pada mikroplate well B1 s.d H1 4. Ditambahkan 50μl larutan PBS pada mikroplate well B2 s.d H2 5. Ditambahkan 100μl antigen pada mikroplate well A1 dan A2 6. Ditambahkan 50 μl larutan PBS pada mikroplate well A3 dan A4 ( sebagai kontrol) 7. Dilakukan pengenceran berseri pada suspensi virus H1N1, yaitu: a. Dari mikroplate well A1 diambil 50μl suspensi virus H1N1, kemudian dipindahkan ke well B1 dihomogenkan; dari well B1 diambil 50μl suspensi virus H1N1, dan dipindahkan ke well C1 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan seterusnya sampai ke well H1, setelah suspensi pada well H1 homogen, diambil 50μl dan dibuang. b. Dari mikroplate well A2 diambil 50μl suspensi virus H1N1, kemudian dipindahkan ke well B2 dihomogenkan; dari well B1 diambil 50μl suspensi virus H1N1, dan dipindahkan ke well C2 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan seterusnya sampai ke well H2, setelah suspensi pada well H2 homogen, diambil 50μl dan dibuang. 8. Mikroplate pada well A1 s.d H1; A2 s.d H2; dan A3 s.d A4 diisi dengan 50μl SDM. 9. Mikroplate digoyang untuk mencampurkan semua campuran SDM dengan suspensi H1N1 10. Mikroplate diinkubasi selama 30menit s.d 60menit, pada suhu ruang (22 0250C). 11. Mikroplate pada well kontrol diamati untuk melihat apakah SDM telah mengendap semua 12. Diamati hasil reaksi pada semua well mikroplate, dan hasilnya dicatat G. Hasil praktikum

1. Interpretasi hasil Positif (+)

: Terjadi aglutinasi / SDM dalam bentuk terlarut (B)

Negatif (-)

: Terjadi pengendapan SDM (A)

Gambar 2: Interpretasi Hasil Uji HA

Titer HA virus dinyatakan sebagai nilai kebalikan dari pengenceran tertinggi antigen (virus) yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi (positif). 2. Hasil Pada praktikum uji HA didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 3: Hasil praktikum uji HA

Kontrol

1

2

Dari gambar uji HA diatas (gambar 3), disajikan dalam bentuk tabel, sebagai berikut: Well A (Pengenceran 1) B (Pengenceran 1/2) C (Pengenceran 1/4) D (Pengenceran 1/8) E (Pengenceran 1/16) F (Pengenceran 1/32) G (Pengenceran 1/64) H (Pengenceran 1/128) Hasil

Tabel 1. Hasil praktikum uji HA 1 2 Kontrol Kontrol + + + + + + + + + + 16HAU

16HAU

H. Pembahasan Titer antibodi adalah pengenceran tertinggi yang menunjukkan aglutinasi atau presipitasi, untuk menentukan titer antibodi dapat dibuat pengenceran serial serum, dan selanjutnya ditambahkan sejumlah antigen yang konstan dan campuran larutan tersebut diinkubasi dan diperiksa untuk aglutinasi atau presipitasi.

Pada praktikum ini dilakukan uji hemaglutinasi pada suspensi antigen (virus H1N1), tujuan dari uji HA ini adalah untuk mengukur titer HA sediaan virus yang akan digunakan untuk uji hambatan aglutinasi (HI). Sebuah suspensi virus dapat mengaglutinasi sel darah merah, sehingga mencegah virus menetap dan keluar dari suspensi. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Dari hasil pengamatan, diamati reaksi positif pada uji HA, dimana titer dapat dinyatakan sebagai kebalikan dari pengencer tertinggi virus yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi (positif). Pada well A1 s.d E1, masih terdapat aglutinasi, yang berarti pada pengenceran virus tertingggi, yaitu pada well E1 (1/16) virus masih mampu mengaglutinasi SDM, pada well A2 s.d E2 yang berarti pada pengenceran virus tertingggi, yaitu pada well E2 (1/16) virus masih mampu mengaglutinasi SDM, masih terdapat aglutinasi; dan well A3 dan A4 terbentuk endapan SDM, yang berarti tidak terdapat aglutinasi SDM, karena tidak ada virus pada well A3 dan A4, dan perlu diingat, bahwa well A3 dan A4 merupakan kontrol negatif, yang berfungsi untuk mengkontrol pengerjaan uji HA terhindar dari kesalahan dan kontaminasi, baik dari alat dan bahan praktikum yang kita gunakan. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi hasil uji HA adalah: ketelitian waktu, kontaminasi kimia dari tabung, pipet atau bahan, kelainan dari sel darah merah dari individu tertentu, kesalahan pengenceran atau pemipetan, atau pipet yang belum terkalibrasi. Jadi hasil uji HA ini mendapatkan hasil, yaitu: 16HAU (Hem-Aglutinasi Unit). I. Kesimpulan Hasil titer HA virus H1N1, adalah: 16 HAU. PRAKTIKUM 2

Uji Hem-Aglutinasi Inhibition (HI)

A. Hari dan tanggal Rabu, 16 Maret 2016, Pukul 11.00 WIB B. Tujuan Praktikum ini bertujuan, untuk mengetahui tingkat kekebalan atau titer antibodi terhadap virus influenza/H1N1. C. Prinsip Antibodi dari pasien akan mengikat virus dan akan menghambat penempelan virus pada sel darah merah, sehingga aglutinasi tidak terbentuk. Antigen (virus H1N1) + Antibodi spesifik → Kompleks antigen-antibodi Kompleks antigen-antibodi + SDM → Pengendapan SDM

Gambar 4.Prinsip Uji HI

D. Landasan teori Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah dan menyebabkan hemaglutinasi. Bila antibodi spesifik dan antigen virus dicampur sebelum ditambahi sel darah merah, hemaglutinasi akan dihambat. Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif (kecuali untuk togavirus) dan sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada protein permukaan yang mudah mengalami perubahan antigenik. Selain itu, uji ini sederhana mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi.8 Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan

antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi.9 Tes

aglutinasi dapat dimodifikasi untuk pemeriksaan antigen yang

terlarut, tes ini disebut hemaglutinasi inhibisi, disebut hemaglutinasi inhibisi karena dapat mengukur kemampuan antigen yang terlarut untuk menghambat aglutinasi antara antigen dengan eritrosit oleh antibodi. Jika sempel mengandung antigen, antigen terlarut akan bersaing dengan eritrosit untuk berikatan dengan antibodi, sehingga menghambat aglutinasi sel darah merah dengan menipiskan atau mengencerkan sampel, anda dapat menghitung jumlah antigen melalui titer pada sempel yang belum diketahui. Hemaglutinasi inhibisi merupakan yang diinduksikan oleh virus sebagai prosedur untuk mengidentifikasi hemaglutinasi oleh virus atau metode untuk mengukur kensentrasi dari antigen terlarut dalam spesimen biologis, dimana spesimen diinduksi dengan antibodi yang spesifik dan kemudian dengan eritrosit.10 Antibodi spesifik terhadap hemaglutinin virus dapat menghambat terjadinya hemaglutinasi. Uji yang digunakan untuk melihat reaksi penghambatan

ini

kemudian

disebut

uji

hambatan

hemaglutinasi

(Haemagglutination Inhibition, HI Test). Reaksi hambatan hemaglutinasi ini dapat digunakan untuk membantu diagnosis laboratorium dalam melakukan identifikasi virus serta dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi dari hasil vaksinasi.7 Secara bahasa haemagglutination inhibition dapat diartikan sebagai hambatan

haemaglutinasi,

sedangkan

haemaglutinasi

merupakan

penggumpalan dari sel darah merah. Kemampuan mengaglutinasi tidak dimiliki oleh semua virus atau bakteri yang menyerang ayam tetapi hanya beberapa virus dan bakteri yang memiliki zat haemaglutinin, diantaranya: paramyxovirus (ND), poxvirus (Pox), adenovirus (EDS), orthomyxovirus (AI), bakteri Mycoplasma sp., Haemophilus paragallinarum, dan Salmonella pullorum. Zat haemaglutinin yang terdapat dalam tubuh virus atau bakteri tersebut bersifat antigenik yang dapat merangsang terbentuknya antibodi spesifik. Antibodi yang terbentuk tersebut memiliki kemampuan mengambat

terjadinya aglutinasi darah yang disebabkan oleh haemaglutinin dari virus atau bakteri. Prinsip dari uji HI lambat, adalah mengetahui adanya antibodi yang mampu menghambat proses hemaglutinasi oleh virus. Uji ini untuk menentukan titik antibodi terhadap hemaglutinasi virus. Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi dihambat, dan eritrosit mengendap. Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit diaglutinasi oleh virus dan membentuk endapan.11 Hemaglutinasi oleh virus dapat dihitung dan dibawah kondisi standar dalam cairan dapat dilihat. Reaksi HA dapat dihambat oleh serum immune (antibodi) yang spesifik. Beberapa strain virus dapat ditunjukkan virulensinya dalam aktivitas HA dengan eritrosit mammalia dan dalam panas yang stabil. Antigen yang tidak signifikan tidak dapat dilaporkan.12

E. Alat dan bahan 1. Peralatan yang digunakan pada praktikum adalah: i.

Mikroplate dengan dasar V.

ii.

Mikropipet 25μl dan 100μl.

iii.

Yellow tip.

iv.

Timer/Jam

v.

Wadah pembuangan.

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah: i.

Sel darah merah (SDM) ayam.

ii.

Antibodi spesifik terhadap virus H1N1 (dari serum rabbit, yang diinjeksi virus H1N1).

iii.

Antibodi normal (dari serum rabbit, yang tidak diinjeksi virus H1N1).

iv.

Suspensi virus H1N1 (yang telah dilakukan pengenceran sesuai dengan hasil uji HA yang sebelumnya dikerjakan).

v.

Larutan PBS/Phospate Buffer Saline.

F. Cara kerja 1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) dengan lengkap dan benar. 3. Pemeriksaan uji HI, yaitu: a. Pada mikroplate well B1 s.d H1 dan B2 s.d H2 diisi dengan 25μl larutan PBS. b. Pada mikroplate well B5 s.d H5 dan B6-H6 diisi dengan 25μl larutan PBS. c. Pada mikroplate well A3 dan A4 diisi dengan 50μl larutan PBS (sebagai kontrol). d. Ditambahkan 50μl serum positif pada well A1 dan A2, serta 50μl serum negatif pada well A5 dan A6 e. Pengenceran bertingkat pada suspensi serum/antibodi positif, yaitu: 1. Dari

mikroplate

pada

well

A1

diambil

25μl

suspensi

serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well B1 dihomogenkan; dari well B1 diambil 25μl suspensi serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well C1 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H1, setelah suspensi pada well H1 homogen, diambil 25μl dan dibuang. 2. Dari

mikroplate

pada

well

A2

diambil

25μl

suspensi

serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well B2 dihomogenkan; dari well B2 diambil 25μl suspensi serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well C2 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H2, setelah suspensi pada well H2 homogen, diambil 25μl dan dibuang. f. Pengenceran bertingkat pada suspensi serum/antibodi negatif, yaitu: 1. Dari

mikroplate

serum/antibodi

pada

well

A5

diambil

negatif,

dan

dipindahkan

25μl ke

suspensi well

B5

dihomogenkan; dari well B5 diambil 25μl suspensi serum/antibodi negatif, dan dipindahkan ke well C5 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H5, setelah suspensi pada well H5 homogen, diambil 25μl dan dibuang.

2. Dari

mikroplate

serum/antibodi

pada

well

A6

diambil

negatif,

dan

dipindahkan

25μl ke

suspensi well

B6

dihomogenkan; dari well B6 diambil 25μl suspensi serum/antibodi negatif, dan dipindahkan ke well C6 dihomogenkan, dan pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H6, setelah suspensi pada well H6 homogen, diambil 25μl dan dibuang. g. Mikroplate pada well A1-H1, A2-H2, A5-H5 dan A6-H6 ditambahkan dengan 25μl suspensi virus H1N1 8HAU; diinkubasi pada suhu ruang (25oC), selama 30 menit. h. Mikroplate pada well A1-H1, A2-H2, A3, A4, A5-H5 dan A6-H6, ditambahkan dengan 50μl SDM, kemudian dicampur dengan baik i. Mikroplate diinkubasi selama 30menit s.d 60menit, pada suhu ruang (250C). j. Mikroplate diamati, dibaca hasil reaksi yang terbentuk pada waktu inkubasi diatas/pada saat well kontrol sudah terbentuk endapan, dan dicatat. k. ihkan alat dan bahan yang digunakan pada praktikum. G. Hasil praktikum 1. Interpretasi hasil Positif (+)

: Tidak ada aglutinasi /terjadi pengendapan SDM/ hambatan aglutinasi (C)

Negatif (-)

: Terdapat aglutinasi / tidak ada endapan SDM (B)

Gambar 5: Interpretasi Hasil Uji HI

Titer HI (antibodi spesifik) dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran tertinggi antibodi spesifik yang masih dapat mengikat antigen/virus H1N1, sehingga terbentuk endapan SDM secara sempurna. 2. Hasil Pada praktikum uji HI didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 6: Hasil praktikum uji HI

Dari gambar uji HI diatas (gambar 6), disajikan dalam bentuk tabel, sebagai berikut: Well

A (Pengenceran 1) B (Pengenceran 1/2) C (Pengenceran 1/4) D (Pengenceran 1/8)

Tabel 3. Hasil praktikum uji HI 4 1 2 3 Serum/Antibodi Kontrol Positif + + + + + + + + + +

5 6 Serum/Antibodi negatif -

-

E (Pengenceran 1/16) F (Pengenceran 1/32) G (Pengenceran 1/64) H (Pengenceran 1/128) Hasil I. Pembahasan

+ -

+ -

-

-

> 128

> 128

-

-

Prinsip HI adalah dengan uji ini diharapkan reaksi aglutinasi dari virus dan SDM dapat dicegah dengan antibodi spesifik yang terdapat dalam serum. Pada uji HI ini kita melihat reaksi antibodi terhadap hemaglutinasi virus, bila terdapat antibodi dalam jumlah yang cukup untuk membentuk kompleks dengan virion virus, hemaglutinasi SDM akan dihambat, sehingga terjadi pengendapan SDM (Reaksi Positif), sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak cukup maka SDM akan diaglutinasi oleh virus dan tidak terbentuk endapan (Reaksi negatif). Dari hasil pengujian ini, diamati pada titer serum/antibodi positif pada uji HI, dimana titer dapat dinyatakan sebagai kebalikan dari pengencer tertinggi serum/antibodi positif yang masih dapat berikatan dengan virus H1N1, sehingga akan terbentuk endapan SDM didasar well. Hasil Positif didapatkan pada well A1 s.d E1dan A2 s.d E2 dimana terdapat endapan SDM didasar well, yang berarti serum/antibodi spesifik berikatan dengan virus H1N1. Hasil Positif juga terlihat pada well kontrol (A3 dan A4), yang berisi SDM tanpa antigen dan antibodi, terjadi pengendapan SDM . Hasil negatif didapatkan pada well A5 s.d H5 dan A6 s.d H6 dimana tidak terbentuk endapan SDM di dasar well, yang disebabkan karena adanya aglutinasi SDM, karena terjadi ikatan antara SDM dan virus H1N1. Aglutinasi ini terjadi disebabkan karena tidak ada/kurangnya antibodi spesifik terhadap virus H1N1. Pada pengerjaan praktikum ini, perlu diteruskan pengenceran berseri dari serum/antibodi spesifik untuk mendapatkan hasil titer serum/antibodi spesifik yang sebenarnya. Pada praktikum ini, pengerjaan uji HA dilakukan secara

duplo, hal ini untuk meningkatan ketelitian pengerjaan, sehingga hasil yang didapatkan lebih akurat. Pengencaran serum/antibodi spesifik perlu dilakukan untuk mendapatkan hasil titer serum/antibodi spesifik yang sebenarnya. Pada praktikum ini didapatkan hasil uji HI, yaitu: 16. J. Kesimpulan Hasil titer uji HI (antibodi spesifik terhadap virus H1N1), adalah: 16.

PRAKTIKUM 3

Uji Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) A. Waktu Pelaksanaan Selasa s.d Rabu, 10 s.d 11 Maret 2015, Pukul 11.00 WIB s.d selesai B. Tujuan Praktikum ini bertujuan, untuk optimasi konsentrasi antibodi untuk pengembangan sistem ELISA. C. Prinsip Coated antigen (protein M) + Antibodi spesifik protein M → Inkubasi + anti antibodi spedifik protein M berlabel biotin → Inkubasi + Enzim (Streptavidine-HRP) + subtract (O-phenylenediamine) → terbentuk warna → diukur pada elisa reader dengan λ=490nm.

Gambar 7: Proses interaksi pada ELISA

D. Landasan teori 1. Pengertian Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.

Penggunaan ELISA, melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikroplate polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi

secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan

enzim melalui biokonjugasi. Diantara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. ELISA mempunyai kelebihan dan kekurangan dalam memeriksa suatu sampel, yaitu: kelebihan teknik ELISA, antara lain : i.

Teknik pengerjaan relatif sederhana.

ii.

Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi).

iii.

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

iv.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen, meskipun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik).

v.

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Kekurangan teknik ELISA, antara lain : i.

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).

ii.

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

iii.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking, sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

iv.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga

pembacaan

harus

dilakukan

dengan

cepat

(pada

perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi). 2. Teknik-Teknik ELISA Ada beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain:13 i.

Direct ELISA Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel direct ELISA, menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada direct ELISA, pertama mikroplate diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang mikroplate, lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubanglubang mikroplate, sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan. Kemudian, ke dalam lubang-lubang mikroplate tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi.

Gambar 8: Direct ELISA

ii.

Indirect ELISA Teknik indirect ELISA ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik indirect ELISA yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. indirect ELISA menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal), serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada indirect ELISA, pertama mikroplate diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding lubang mikroplate, kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikroplate, sehingga terjadi terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang dinginkan. Lalu ke dalam lubang mikroplate dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang mikroplate tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan, dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Pada tahap akhir indirect ELISA, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

Gambar 9: Indirect ELISA

iii.

Sandwich ELISA Sandwich ELISA, menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari sandwich ELISA mirip dengan direct, ELISA hanya saja pada direct,, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik

direct, ini cenderung

dikhususkan pada antigen memiliki minimal dua sisi antigenik (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent, seperti: polisakarida atau protein. Pada sandwich ELISA, antibodi primer, seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, dan antibodi sekunder, seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam

pengaplikasiannya,

sandwich

ELISA lebih

banyak

dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan sandwich ELISA memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Gambar 10: Sandwich ELISA

iv.

Competitive ELISA Competitive ELISA, merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini, adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang mikroplate. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi.

Gambar 11: Competitive ELISA

E. Alat dan bahan 1. Peralatan yang digunakan pada praktikum adalah: i.

Mikroplate ELISA.

ii.

Adjustable mikropipet 100μl.

iii.

ELISA reader

iv.

Inkubator

v.

Yellow tip.

vi.

Timer/Jam.

vii.

Pipet

viii.

Wadah pembuangan.

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah: i.

Coated- Antigen (protein M) 25μg/mL (telah disiapkan sebelumnya)

ii.

Antibodi 1, yaitu: a. Antibodi spesifik terhadap protein M b.

Antibodi tidak spesifik terhadap protein M (kontrol),

iii.

Washing buffer (PBS Tween 0,05%).

iv.

Blocking solution (Skim milk 5%).

v.

Antibodi 2, yaitu: antibodi anti rabbit berlabel biotin 1/10000

vi.

Streptavidine-HRP (1/20000).

vii.

Substrate OPD (O-phenylenediamine).

viii.

Stop solution (H2SO4 2,5N)

ix.

Kertas tissue

F. Cara kerja

1. (Melabel well): Mikroplate diisi Coated- Antigen (protein M) pada well uji A1-A12, B1-B12, C1-C12, D1-D12

dan well kontrol F1 dan F2

dengan konsentrasi 25 μg/mL. Antigen dilarutkan dalam Carbonate Coating Buffer, pH 9,6 (0,15 M sodium carbonat; 0,35 M sodium bicarbonate; 0,03 M sodium azide). Mikroplate diinkubasi 37oC, selama 1 jam 2. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing buffer.

3. (Blocking): Mikroplate diisi blocking solution sebanyak 70 μL. Mikroplate diinkubasi 37oC, selama 1 jam. 4. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing buffer. 5. (Penambahan antibodi 1): 150 μL diencerkan dengan 150 μL dilution buffer (0,1 skim milk dalam PBS). Selanjutnya antibodi diencerkan mulai dari 1/2; 1/4; 1/8; dan seterusnya dengan pengencer PBS (pengenceran berseri). 50 μL antibodi berbagai konsentrasi ditambahkan ke dalam well. Antibodi paska vaksinasi ditambahkan dalam dalam well A dan B, sedangkan antibodi kontrol negatif dalam well C dan D. Mikroplate diinkubasi dengan suhu 4oC, selama semalam. 6. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing 7.

buffer. (Penambahan antibodi 2): 50 μL antibodi anti rabbit berlabel biotin

1/1000 ditambahkan di setiap well uji 8. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing buffer. 9. (Penambahan Streptavidine-HRP): 50 μL Streptavidine-HRP (horseradish peroksidase) dalam PBS 1/5000 ditambahkan ke setiap well uji. Mikroplate diinkubasi 37oC, selama 1 jam. 10. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing 11.

buffer. (Penambahan

substrat

OPD):

50

μL

Substrat

OPD

(O-

phenyldenediamine) ditambahkan ke well. OPD dibuat dengan melarutkan 10 mg OPD dalam 10 mL buffer substrat ditambah 240 μL H2O2 3%. Mikroplate diinkubasi dalam suhu ruangan sekitar 15 menit. 12. (Stop solution): 25 μL H2SO4 2,5 M ditambahkan pada setiap well. 13. (Pembacaan hasil): Baca absorbansi larutan yang terbentuk dalam panjang gelombang 490 nm. 14. (Analisis data): Berdasarkan hasil absorbansi, dibuat kurva setiap pengenceran antigen dengan program excel. Sumbu X: pengenceran, sumbu Y: antibodi H. Hasil praktikum Pada praktikum uji ELISA didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 12: Hasil praktikum uji ELISA

Setelah dibaca pada ELISA reader dengan λ= 490nm didapatkan hasil absorbansi dari setiap well, hasilnya disajikan pada table berikut:

A B C D E F G H

1 0.32 5 0.36 9 0.04 9 0.04 8 0.04 8 0.04 6 0.04 3 0.05 6

2 0.37 1 0.42 9 0.04 6 0.04 5 0.04 4 0.05 3 0.03 9 0.05 8

3 0.35 3 0.38 5 0.04 4 0.04 5 0.03 9 0.03 7 0.04 0.04 4

4 0.27 5 0.33 0.04 3 0.04 9 0.03 8 0.03 7 0.03 7 0.04

5 0.53 1 0.33 8 0.04 3 0.04 4 0.04 6 0.03 8 0.03 8 0.03 5

6 0.13 1 0.32 0.04 4 0.05 0.03 6 0.03 8 0.03 7 0.03 8

7 0.21 1 0.27 4 0.04 2 0.05 8 0.04 7 0.03 9 0.03 9

8 0.23 5 0.19 4 0.04 1 0.04 6 0.04 1 0.03 9

0.04

0.04

0.04

9 0.15 5 0.12 8 0.04 4 0.04 8 0.03 6 0.04 5 0.03 9 0.04 8

10 0.05 9 0.08 6 0.04 3 0.04 7 0.03 7 0.04 5 0.05 7 0.05 4

11 0.06 1 0.06 6 0.04 8 0.04 9 0.03 6 0.04 0.04 3 0.05 7

12 0.04 9 0.05 4 0.04 6 0.04 8 0.03 6 0.04 3 0.04 5 0.04 1

1:10 24 0.07 3 0.04 5 0.04 5

1:20 48 0.06 4 0.04 9 0.04 0

Tabel 4. Hasil pengukuran pada ELISA reader

positi f negat if kontr ol

1:2 0.34 7 0.04 9 0.04 6

1:4 0.40 0 0.04 6 0.05 3

1:8 0.36 9 0.04 5 0.03 7

1:16 0.30 3 0.04 6 0.03 7

1:32 0.43 5 0.04 4 0.03 8

1:64 0.22 6 0.04 7 0.03 8

1:12 8 0.24 3 0.05 0 0.03 9

1:25 6 0.21 5 0.04 4 0.03 9

1:51 2 0.14 2 0.04 6 0.04 5

Tabel 5. Nilai Rata-rata Pembacaan dengan Mircoplate Reader

1:40 96 0.05 2 0.04 7 0.04 3

1/2

1/4

positi f 0.2975 negat if -0.0005 Rata- Rata kontrol

1/8 0.36 9 0.04 5

0.4 0.04 6

1/16 0.30 3 0.04 6

1/32 0.43 5 0.04 4

1/64 0.22 6 0.04 7

1/12 8 0.24 3 0.05

1/25 6 0.21 5 0.04 4

1/51 2 0.14 2 0.04 6

1/102 4

1/204 8

1/409 6

0.073

0.064

0.052

0.045

0.049

0.047

0.0495

Tabel 6. Hasil Pengurangan Nilai Rata-rata dengan Rata-rata Kontrol

Dari tabel diatas , disajikan dalam bentuk grafik, sebagai berikut:

Grafik ELISA 0.5 0.4 0.3

OD 490nm

0.2 0.1 0 -0.1

Pengenceran positif

negatif

kontrol

Grafik 1: Absorbansi antibodi pada berbagai titer pengenceran

I. Pembahasan Pada praktikum ini menggunakan teknik Indirect ELISA. Tujuan dari uji ELISA ini adalah untuk mengukur titer antibodi yang paling tinggi yang dapat berikatan dengan baik, sehingga dihasilkan reaksi warna yang paling baik pada pengukuran pada ELISA reader, proses ini juga disebut optimasi ELISA. Pengujian dilakukan menggunakan suspensi antigen/Protein M dari virus H1N1, dengan serum yang mengandung antibodi spesifik antigen/Protein M

dari virus H1N1 (serum post vaksinasi) dan serum yang tidak mengandung antibodi spesifik terhadap virus H1N1 (serum yang tidak divaksinasi). Mikroplate pada well A1 s.d A12, B1 s.d B12, C1 s.d C12, D1 s.d D12, F1 dan F2 telah diisi dengan 60μl larutan Coated- Antigen (protein M) 25μg/mL, dan

diinkubasi

37oC,

selama

60

menit.

Bahan

plate

polystyrene

memungkinkan untuk antigen dapat menempel dengan baik di dasar well mikroplate. Mikroplate kamudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan washing buffer. Hal ini bertujuan untuk ihkan Coated-Antigen (protein M) yang tidak dapat menempel dengan baik didasar well dapat dihilangkan, dan untuk menghilangkan gelembung yang terbentuk di dasar well yang dapat mengganggu pembacaan hasil ELISA. Tahapan berikutnya adalah penambahan blocking solution, yang bertujuan untuk mengisi celah-celah yang tidak terdapat Coated- Antigen (protein M) pada dasar well sehingga mencegah terjadinya ikatan yang tidak spesifik antara antibody dan antigen. Pada tahapan penambahan antibodi 1 (antibodi spesifik terhadap antigen/protein M virus H1N1 dan antibodi tidak spesifik terhadap antigen/protein M virus H1N1), bertujuan agar antibodi yang ditambahkan dapat berikatan/berinteraksi dengan Coated-Antigen (protein M) yang sebelumnya telah ditambahkan. Diharapkan terbentuk ikatan yang spesifik antara antigen Protein M dengan antibody yang spesifik (berasal dari serum yang telah divaksinasi sebelumnya). Diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam agar terjadi reaksi yang optimal. Pada tahapan penambahan antibodi 2 (yaitu: antibodi anti rabbit berlabel biotin), bertujuan agar antibody 2 tersebut dapat berikatan secara spesifik dengan antibodi pertama. Inkubasi agar dapat terjadi interaksi yang optimal. Tahapan washing, setelah inkubasi bertujuan, ihkan antibodi 2 yang tidak berikatan dengan antibodi 1, selain itu tahapan washing juga harus menghilangkan gelembung udara yang ada didasar well yang terjadi pada tiap proses tahapan pengerjaan uji ELISA. Biotin yang menempel pada antibody 2 ini berfungsi sebagai tempat perlekatan dengan enzim yang nantinya akan

ditambahkan (Streptavidine-HRP). Enzim HRP (Horseradish Peroxidase) yang berikatan dengan protein Streptavidine (dari Streptococcus avidin) membentuk kompleks Streptavidine-HRP. Ikatan molekul biotin dan streptavidine merupakan ikatan nonkovalen yang kuat dan spesifik, sedangkan enzim HRP merupakan enzim yang akan mengkatalisis substrat, dalam praktikum ini O-phenylenediamine, yang menghasilkan produk yang menimbulkan kompleks warna (kuning). Pada penambahan substrat reaksi warna segera terbentuk, sehingga harus segera ditambahkan stop solution (H2SO4 2,5N), dengan tujuan agar reaksi katalis enzim terhadap subtrat dapat dihentikan (mempengaruhi pH larutan, sehingga enzim tidak dapat bekerja), jika tidak maka subtrat akan dikatalis sampai habis oleh subtrat, sehingga warna yang terbentuk menjadi lebih rendah dari sebenarnya, yang akan menyebabkan nilai absorbance pada pembacaan dengan elisa reader menjadi juga rendah. Penggunaan asam kuat (H2SO4 2,5N), sebagai stop reaksi, karena substrate O-phenylenediamine, yang digunakan bersifat basa, sehingga dapat menetralkan reaksi tersebut. Intensitas warna yang terbentuk akan sebanding dengan kadar antibodi dalam sampel yang diperiksa yang diukur absorbansinya dengan Elisa reader pada panjang gelombang 490 nm. Dari hasil pengamatan, terbentuk warna kuning tua pada well yang berisi antibodi spesifik antigen/protein M dari virus H1N1 (well A1, B1) yang semakin ke kanan (dari well A2-A12, dan B2-B12) terjadi gradasi warna lebih cerah (dari kuning tua ke kuning cerah) seiring dengan penurunan titer antibody spesifik (dari titer antibody 1/2 sampai 1/4096). Pada well dengan antibody tidak spesifik (C1-C12, D1-D12) tidak terbentuk warna kuning, hal ini dikarenakan antibody 1 tidak berikatan secara spesifik dengan antigen, sehingga antibody 2 juga berikatan dengan antibody 1 dan subtrat tidak bisa bereaksi dengan enzim sehingga tidak terbentuk kompleks warna. Hasil negatif juga terjadi pada well kontrol (F1,F2) karena tidak terdapat antibodi. Pada pembacaan dengan ELISA reader didapatkan nilai absorbansi yang menurun sejalan dengan penurunan titer antibodi (Grafik.1 absorbansi antibodi pada berbagai titer pengenceran). Titik dimana terjadi perbandingan selisih maksimal antara absorbansi dari well yang berisi antibodi spesifik dan

tidak berisi antibodi spesifik menandakan titik optimasi. Pada praktikum ini didapatkan pada titer pengenceran antibodi 1/4 ( Mean absorbansi antibodi spesifik = 0,400 mean absorbansi antibodi nonspesifik 0.046, selisih = 0.354 ). Dalam pengerjaan ELISA ini perlu memperhatikan beberapa hal agar mendapatkan hasil yang valid, yaitu harus memperhatikan ketelitian pengerjaan, teknik pipetting, suhu dan waktu yang tepat. Dalam praktikum ini dilakukan duplo untuk mengurangi ketidaktelitian, akan tetapi masih terjadi beberapa kesalahan, seperti pada well B5 (absorbansi 0.054, pengenceran 1/32), B8 (absorbansi 0,059, pengenceran 1/256) dan B9 (absorbansi 0,054, pengenceran 1/512), nilai absorbansinya terlalu rendah (jauh signifikan dibandingkan pada well A5, A8 dan A9. Hal ini tentu akan mempengaruhi nilai rata-rata absorbansi pada pengenceran tersebut (1/32, 1/256, 1/512), sehingga pada saat menghitung absorbansinya tidak dirataratakan tetapi diambil nilai absorbansi dari well A5, A8 dan A9. Kesalahan ini terjadi karna pada saat pengisian well duplo mungkin karena ketidaktelitian dalam pengerjaan, pippeting ataupun karena mikropipet yang tidak terkalibrasi. Kedepannya hal ini harus dibenahi.

J. Kesimpulan Titer antibodi yang baik pada konsentrasi antigen 25g/mL adalah: 1/4.

DAFTAR PUSTAKA 1.

Campbell NA, Reece JB. Biology. 6th ed. San Fransisco: Pearson Education Inc; 2002

2.

Becker WM, KleinsmithLJ, Hardin J. The World of The Cell. 4 th ed. San Fransisco: Addison Wesley Longman, Inc; 2000

3.

Schlegel HG, and K Schmidt.Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Gajah Mada University Press; 1994,

4.

Burleson FG, TM Chambers, and DL Wiedbrauk. Virology and Laboratory Manual. San Diego: Harcourt Brace Jovanovich; 1992.

5.

Asmara W. Peran Biologi Molekuler Dalam Pengendalian Avian Influenza dan Flu Burung [ Pidato Pengukuhan Guru Besar Fakultas Kedokteran Hewan]. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada; 2007.

6.

Raharjo Y, dan Nidom CA. Avian Influenza; Pencegahan, Pengendalian dan Pemberantasannya. Hasil Investigasi Kasus Lapangan. Jakarta: Gita Pustaka; 2004.

7.

L Amaliani. Pemeriksaan Hemaglutinasi Virus Influenza [internet]. April 2011 [cited 26 maret 2016]. Avalaible from: http://lestariamaliani.blogspot.com/2011/11/pemeriksaan-hemaglutinasivirus.html.

8.

Fenner F. Virology Veteriner. 2nded. New York: Academic Press Inc; 1993.

9.

Stephen BH. Isolation and Identification of Avian Pathogen. Texas: American Association of Avian Pathologist Departement of Veterinary Microbiology; 1980.

10.

Mayer. Microbiology and Immunology on Line. Washington: University of South Carolina School of Medicine: 2010.

11.

Allan W H, JE Lancaster, and B Toth. Their Production and Use of Newcastle Disease Vaccin. FAO. 1978; 1-79.

12.

RM Aloisi. Principles of Immunodiagnostics. English: Mosby; 1979.

13.

Pandu. Test ELISA [internet]. Juni 2012 [cited 26 Maret 2016]. Available from: http://pandudingin.blogspot.com/2012/04/elisa-test.html.