Rekayasa Genetika 4h94x

REKAYASA GENETIKA

1.

Pengertian Rekayasa Genetika Rekayasa genetika adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan. DNA Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ “kendaraan pemindah”. Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:

§ Teknik mengisolasi DNA; § Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease; § Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase; § Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor) § Vektor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa. Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu plasmid dan enzim. 1)

Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA berantai rangkap dan berbentuk cincin. Plasmid ditemukan didalam sel bakteri dan dapat berbiak secara bebas, lepas dari kromosom induk. Dalam rekayasa genetika, plasmid berperan sebagai vektor (kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing. Keuntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke sel yang lain, misalnya melalui cara transformasi. Ketika satu gen “asing” (biasanya diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik) telah disisipkan ke dalam satu plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut gen ke dalam sel bakteri. Plasmid yang membawa gen tersebut siap di absorpsi dan di replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang dihasilkan akan mewarisi gen- gen baru. Selanjutnya, setiap bakteri didalam kultur gen- gen akan menginstruksi, misalnya “hasilkan hormon insulin manusia”. Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah: § Konjugasi: pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar kedua sel. § Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekitarnya. § Transduksi: pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui perantara

2)

Enzim

Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan penting. Kedua macam bahan kimia tersebut adalah enzim pemutus (retriksi endonuklease) dan enzim perekat (ligase). Enzim retriksi endonuklease merupakan enzim khusus dari bakteri yang berguna sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya untuk melawan DNA asing yang menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa genetika, enzim tersebut bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi untuk memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus. Enzim retriksi endonuklease memiliki dua keutamaan. Pertama, memiliki fungsi kerja spesifik. Dalam hal ini enzim mampu mengenal dan memotong urutan nukleotida tertentu pada DNA. Kedua, mampu menghasilkan potongan- potongan runcingketika memotong rantai ganda DNA. Fragmen- fragmen yang dihasilkannya adalah berupa ujung runcing (ujung lengket) yang terdiri atas untaian tunggal. Setiap ujung dari fragmen memiliki bagian yang menjorok dengan urutan basa yang dapat dikenali dan dipasangi oleh basa yang terletak di ujung untaian lainnya. Misalnya, ujung untaian tunggal dengan urutan basa AATT pada satu ujung dan TTAA pada ujung yang lain. Kedua fragmen tersebut dapat disambungkan sehingga membentuk satu untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim ligase berfungsi untuk merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/ potongan- potongan DNA.

2.

a)

Teknik- teknik Rekayasa Genetika

Teknik Plasmid Rekayasa Genetika Melalui teknk plasmid dalam rekayasa genetika, para ahli dibidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit, adaptif kekeringan dan kondisi tanah yang tidak subur, hewan transgenik dan lain- lain.

Gambar. Rekayasa genetika dengan plasmid bakteri

b)

Teknik Hibridoma Teknik hibridoma adalah penggabungan dua sel dari organisme yang sama ataupun dari sel organisme yang berbeda sehingga menghasilkan sel tunggal berupa sel hibrid (hibridoma) yang memiliki kombinasi sifat dari kedua sel tersebut. Contoh teknik hibridoma adalah pembuatan antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel klon yang hanya mengenal satu jenis antigen. Pembentukan antibodi monoklonal dilakukan dengan menggunakan kelinci atau tikus. Langkah pertama adalah menginjeksikan antigen ke tubuh kelinci atau tikus percobaan, kemudian limpanya dipisahkan. Selanjutnya dilakukan peleburan sel- sel limpa dengan selsel mieloma (sel- sel kanker). Sekitar 1% dari sel limpa adalah sel plasma yang menghasilkan antibodi. Sedangkan 10% sel hibridoma akhir terdiri dari sel yang menghasilkan antibodi. Setiap sel hibridoma hanya menghasilkan 1 antibodi. Disini teknik seleksi dikembangkan untuk mengidentifikasi sel hibridoma, kemudian dilakukan pengembangan atau pengklonan berikutnya. Klon yang diperoleh dari hibridoma berupa antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal dapat disimpan beku, kemudian dapat diinjeksikan ke dalam tubuh hewan atau dibiakkan dalam suatu kultur untuk menghasilkan antibodi dalam jumlah besar.

Gambar. Tehnik pembuatan antibodi monoklonal oleh Kohler dan Milstein Kegunaan antibodi monoklonal: ü Para ilmuwan berharap dapat menggunakan antibodi monoklonal dalam pemgobatan kanker. ü Untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin (HCG) dalam urine wanita hamil.

ü Untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan kelebihan obat digoxin dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini. ü Mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.

a)

Teknik Terapi Genetik

Terapi gen diartikan sebagai upaya memperbaiki atau mengganti gen- gen yang menyebabkan suatu penyakit. Terapi ini dilakukan dengan mengganti gen- gen yang tidak dapat bekerja dengan salinan gen yang normal ke dalam sel. Pada pertengahan tahun 1990, terapi genetik untuk mengobati penyakit menurun dan kanker kulit ganas. Para ahli berusaha melawan gen- gen perusak dalam inti sel itu dengan berbagai cara, upaya yang dirintis tersebut dikenal dengan terapi genetik. Sayangnya penemuan itu tidak segera dapat diterapkan. Dalam rekayasa genetika ada kode etik yang melarang keras percobaan ini pada manusia. Rekayasa ini dikhawatirkan disalahgunakan untuk mengubah gen pembawa sifat manusia, misalnya untuk membuat manusia super. Namun para ahli tidak selamanya bersikap kaku sebab berbagai penyakit fatal memang susah disembuhkan kecuali dengan terapi genetik. Maka munculah pendapat tentang perlu adanya dispensasi. Dispensasi itu dikeluarkan oleh Komite Rekayasa Genetik Nasional Institut of Healt (NIH) di Amerika Serikat yang mengizinkan penerapan terapi genetik untuk dua jenis penyakit yaitu penyakit menurun yang sangat jarang seperti Adenosine Deaminase Deficiency (ADD) dan sejenis kanker kulit yang ganas. ADD adalah kelainan yang menyebabkan penderitanya tidak memiliki daya tahan tubuh sama sekali. Kontak dengan kuman apapun akan menyebabkan kematian. Rusaknya kekebalan pada ADD terjadi akibat sel- sel darah tidak mampu memproduksi enzim Adenosine Deaminase (AD) yang diperlukan untuk membangun daya tahan tubuh. b)

Teknik Kloning

Kloning berasal dari kata Yunani kuno, clone yang berarti ranting atau cangkokan. Dalam bahasa Inggris,clone (klona) digunakan untuk menyebut sekelompok makhluk hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual. Istilah clone (klona) pertama diusulkan oleh Herbert Webber pada tahun 1903. Kloning dapat dilakukan dengan transfer gen, transfer embrio dan transfer inti. Organisme hasil kloning akan memiliki salinan genetika yang sama persis dengan makhluk hidup yang lain. 1. Transfer Gen Kloning ini dilakukan dengan menyisipkan potongan gen yang dikehendaki dari suatu spesies lain sehingga spesies ke spesies lain sehingga spesies yang di klon tadi akan memiliki sifat tambahan sesuai dengan gen yang telah di sisipkan ke dalam sel tubuhnya. 2.

Transfer Embrio Transfer embrio ini dilakukan dengan jalan mengambil ovum kemudian membuahinya dengan sperma, setelah terjadi zigot yang akan berkembang menjadi embrio, embrio- embrio ini di transfer atau ditanam dalam rahim individu betina sampai lahir menjadi individu dewasa.

3.

Transfer Inti Prinsip dari transfer inti yaitu dengan memasukkan inti sel (nukleus) dari satu spesies ke dalam sel spesies lain yang sebelumnya inti selnya telah dibuang atau dikosongkan. Pada tahun 1952, Robert Brigs dan Thomas J. King (AS) mencoba teknik kloning pada katak. Sepuluh tahun kemudian (1962), John B. Gurdon juga mencoba teknik kloning pada katak, namun prcobaannya menghasilkan banyak katak yang abnormal atau cacat. Gurdon kemudian menyempurnakan percobaannya sehingga menghasilkan banyak katak yang tumbuh normal dan berkembang menjadi dewasa. Pada tahun 1986, Steen Wikkadsen (Inggris) mengklona sapi dengan tujuan komersial dengan metode transfer inti. Ia bekerja sama dengan Lembaga Grenada Genetics. Pada tahun 1996, Ian Wilmut mengklona domba. Ia menggunakan sel kelenjar susu domba finn dorsetsebagai donor inti dan sel telur domba blackface sebagai resipien. Sel telur domba blackface dihilangkan intinya dengan cara mengisap nukleusnya keluar dari sel menggunakan pipet mikro. Kemudian, sel kelenjar susu dombafinn dorset difusikan dengan sel telur blackface yang tanpa nukleus. Hasil fusi ini kemudian berkembang menjadi embrio dalam tabung percobaan dan kemudian dipindahkan ke rahim domba blackface. Kemudian embrio berkembang dan lahir dengan ciri- ciri sama dengan finn dorset. Domba hasil kloning ini diberi nama Dolly. Dolly disuntik mati pada tanggal 14 februari 2003 karena menderita penyakit yang sulit disembuhkan. Perlu diperhatikan bahwa Wilmut melakukan 277 percobaan kloning dan dari sekian banyak percobaan, hanya 29 yang berhasil menjadi embrio domba yang dapat ditransplantasikan ke rahim domba, dan hanya satu yang menjadi domba normal. Dengan demikian, tingkatkeberhasilan kloning domba masih sangat rendah (Purves et al. 2004).

Plasmid dan Penggunaannya dalam Rekayasa Genetika A. Pengertian Plasmid Sebagai Vektor dalam Rekayasa Genetika

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa genetika.

a. b. c. d.

1. 2. 3. 4.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain : berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded) dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti terdapat di luar kromosom secara genetik dapat ditransfer secara stabil Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat diantaranya sebagai berikut : ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang

Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu : 1. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR 322 2. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid Ti Gambar plasmid pBR 322 dengan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar1.

Gambar 1. Plasmid pBR 322 Gambar plasmid pUC 19 dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar2.

Gambar 2. Plasmid pUC 19 B. Kegunaan Plasmid Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut. C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika

1. 2. 3.

4. 5.

Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut : penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1 langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai pada daerah potongannya plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid

D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah: 1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut 2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya 3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end). Perbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end dapat dilihat pada tabel 1. berikut ini.

Berbagai contoh restriksi enzim yang mengenali pada situs pemotongan tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 2.

Proses pemotongan DNA digambarkan pada gambar 3. berikut ini

Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut: 1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong 2. penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu dengan ujung 5’P dari utas yang lain 3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu. Gambar struktur enzim ligase dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini :

Gambar 4. Struktur enzim ligase Proses penyambungan DNA ligasi pada daerah pemotongan digambarkan pada gambar 5.

Gambar 5. Penyambungan DNA ligase pada potongan DNA F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan Plasmid Rekombinan Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut: 1. menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu 2. menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor 3. pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzim restriksi semisal dari E. coli

4.

pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim restriksi yang sama yaitu E. Coli 5. hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu 6. terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat pada gambar 6 berikut ini.

Gambar 6. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing G. Plasmid Ti Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning, akan tetapi ada suatu bakteri yaituAgrobacterium tumefaciens yang dapat membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing atau penyebab tumor). BakteriAgrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti yang disebut dengan T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman menyebabkan pertumbuhan sel-sel yang tak terkendali, akibatnya akan terbentuk tumor. Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan diekspresikan dengan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam prakteknya ukuran plasmid yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada dalam satu selAgrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya

dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E. Coli. Selanjutnya plsmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciensyang membawa plamid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada TDNA.

Gambar. Plasmid Ti Pemanfaatan plasmid Ti dalam rekombinan tumbuhan sudah banyak dimanfaatkan seperti plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk pembuatan tanaman kapas Bt yang tahan terhadap hama ulat. Ulat yang memakan tanaman akan mengalami kematian. Pemanfaatan plamid ini juga untuk meningkatkan produksi tanaman. Misalkan saja tanaman yang mengandung protein tertentu setelah direkayasa dengan menggunakan plasmid rekombinan ini. Sehingga pada saat makan tanaman ini sudah mengandung protein tertentu.

Gambar. Rekayasa tanaman dengan menggunakan Plasmid Ti

Dari gambar di atas dapat dijelaskan bahwa penggunaan plasmid Ti dilakukan dengan cara menyambung plasmid dengan DNA asing. Pemotongan DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi kemudian masing-masing potongan dilekatkan dengan ligasi DNA terbentuklah plasmid rekombinan. Sebagai hasilnya plasmid rekombinan dimasukan dalam nukleus tanaman melalui fusi protoplasma dan plasmid rekombinan akan berfusi dengan inti tanaman. Protopalasma selanjutnya dikulturkan dalam media kultur jaringan kemudian setelah terbentuk tanaman, setelah itu tanaman ditumbuhkan pada habitatnya. Tanaman yang dihasilkan akan memiliki sifat tertentu sesuai dengan sifat DNA asing yang digunakan. Sehingga apabila kita memakan tanaman tersebut berarti telah mengkonsumsi protein tertentu. Sifat inilah yang mulai dikembangkan pada tanaman.