Efecto De Ph Sobre B-amilasa 1 Pdf 23642c
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Ingeniería de las enzimas. 1
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA β-‐amilasa Johanna Elizabeth Fiallos Núñez Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Ingeniería Bioquímica. Universidad Técnica de Ambato. Ambato – Ecuador.
RESUMEN La actividad catalítica de la enzima β-‐amilasa se determinó mediante el estudio del efecto del pH sobre la misma; la enzima fue sometida a distintos valores de pH, realizando en total 6 ensayos. Para la obtención del pH óptimo de la enzima, en donde alcanza su máxima actividad catalítica, se calculó el porcentaje de actividad mediante la aparición de maltosa como producto. El pH de la enzima donde se evidenció mayor actividad es de 5,4598; sin embargo al calcular el pH óptimo de la enzima se obtuvo un valor de 4,9948, siendo este el pH en donde la enzima presenta una buena actividad catalítica. INTRODUCCIÓN La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado ó sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación del enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción (ALDAVE, 2011). La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reacción. La curva actividad-‐pH puede ser diferente para cada tipo de enzima. En el caso más general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es máxima se denomina pH optimo; dicho pH no tiene porqué coincidir con el pH intracelular. La relación entre el pH y la actividad depende del comportamiento ácido-‐base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su grado de disociación dependiente del pH, lo que determinará, entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unión del sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de los enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la catálisis (ALDAVE, 2011). El presente trabajo tiene como objetivo determinar la influencia del pH sobre la actividad de la enzima B-‐amilasa así como también su pH óptimo.
MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml): Se preparó las soluciones de ácido acético y acetato de sodio 0,02M y se las mezclo hasta conseguir que el pH de la mezcla sea de 4,5 (relación de mezcla aproximada de 1:1). Soluciones tampón citrato-‐fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml): Se mezclaron las soluciones de ácido cítrico (0,05 M) y fosfato dibásico de sodio (0,1 M) de modo que el pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados. Soluciones de almidón al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-‐fosfato: Se pesó la cantidad de almidón soluble correspondiente y se suspendió en 20 ml de tampón citrato-‐fosfato, se calentó la suspensión bajo agitación y se dejó hervir durante 3 min. Se enfrió y restituyo el agua evaporada. Se midió el valor de pH de cada sustrato (valor real que será usado para la gráfica y el cálculo del pH óptimo). Solución de enzima 1/40 en tampón acetato (10 ml).-‐ Se preparó la dilución final de la enzima por diluciones sucesivas (1ª dil 1/10; 3,0 mL) y (2ª ¼; 10 mL). Preparación de la curva estándar de Maltosa: Se utilizaron los valores de absorbancia y concentraciones de la curva estándar de maltosa de la práctica 1. Determinación de la actividad inicial a 20 °C: Se colocó en una gradilla 36 tubos bacteriológicos perfectamente lavados y marcados con el valor de pH; 3 tubos por cada valor de pH más un blanco. Se añadió a cada tubo 0,4 ml de la solución de sustrato y se los termostatizó a 20°C al igual que la solución de enzima por 10 minutos. Se agregaron 0,1 ml de la solución de enzima a cada una de las réplicas, se dejó que la reacción proceda durante 3 minutos y se detuvo la reacción con la adición de 0,5 ml de solución de DNS. Se mezcló bien, se dejó hervir por 5 minutos, se enfrió, se añadió 5 ml de agua destilada y se leyó la absorbancia a 540 nm frente a un blanco preparado invirtiendo el orden de adición de los reactivos (enzima, DNS y sustrato). RESULTADOS La estructura tridimensional de una enzima de origen proteico determina su sitio catalítico y, por lo tanto, su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no covalentes (hidrofóbicos, puentes de hidrógeno, atracciones electrostáticas) y covalentes (puentes de disulfuro) que existen entre los grupos R de los aminoácidos. Los cambios de pH modifican las cargas de los grupos R de los aminoácidos que no son neutros, e interfieren con las atracciones electrostáticas y su estabilidad estructural tridimensional, lo que provoca una pérdida total o parcial de la actividad enzimática. (QUESADA, 2008) Las enzimas son proteínas, como tales poseen grupos ionizables cuyo estado depende del valor del pH; por lo tanto la acción de las enzimas se altera al variar éste parámetro y es preciso controlarlo por medio de un tampón si se quiere obtener resultados concordantes. La influencia del pH sobre la actividad catalítica de la enzima β-‐amilasa fue estudiada experimentalmente mediante la
Ingeniería de las enzimas. 3 realización de 8 ensayos en donde los pH a los cuales la enzima fue sometida son los siguientes: 3.0, 3.5, 4.0, 6.0, 6.5, 7.0. Experimentalmente, se estudió la actividad de la enzima β-‐amilasa a distintos valores de pH, la cual se ve afectada por la concentración de iones de hidrógeno presentes en el medio afectando el grado de ionización de los aminoácidos presentes en el sitio activo. En general, la mayoría de las enzimas son activas dentro de un estrecho rango de pH, siendo de 5 a 9. Esto es consecuencia de los efectos de pH sobre la unión del sustrato a la enzima, la actividad catalítica de la enzima, la ionización del sustrato y la variación de la estructura proteica. Se utilizó almidón como sustrato para la enzima β-‐amilasa, la cual generó como producto maltosa; la generación de producto permite evidenciar la actividad de la enzima β-‐ amilasa sometida a distintos valores de pH.
In.luencia del pH sobre la velocidad catalítica de la β-‐amilasa
% Actividad
85,00 65,00
y = -‐8,9776x2 + 89,682x -‐ 126,31 R² = 0,8667
45,00 0.003 0.003 0.004 0.004 0.005 0.005 0.006 0.006 0.007 0.007 pH
Figura # 1: “Efecto del pH sobre la actividad catalítica de la β-‐amilasa” A cierto pH las cargas de los residuos de los aminoácidos que participan en el sitio activo están en condiciones óptimas para la actividad catalítica sobre el sustrato correspondiente. Por lo tanto, a ese pH la velocidad de la reacción será máxima y ese pH es conocido como pH optimo de la enzima. Por supuesto, en valores de pH demasiado ácidos o alcalinos, no solamente podrá estar modificado el sitio activo, sino que la estructura terciaria de toda la molécula se encontrara alterada y no habrá actividad enzimática. El pH óptimo de la enzima β-‐amilasa es de 4,9948, en donde la enzima adquirió su mayor actividad catalítica y este fue calculado mediante regresión cuadrática ya que la grafica presenta una curva en forma de campana lo que refleja la ionización de residuos de aminoácidos que deben estar en un estado de ionización especifico para tener actividad enzimática. El pH óptimo de la enzima β-‐amilasa bibliográfico es de 5 a 6 lo cual indica que el obtenido en el laboratorio esta dentro del rango ya que presenta un pH óptimo de 4,9948.
CONCLUSIÓN Se determinó la influencia que tiene el parámetro de pH sobre la actividad de la enzima β-‐amilasa, en donde se puede concluir que la enzima presenta mayor porcentaje de actividad a 5,4598 ya que ahí se observa mayor producción de maltosa a partir del sustrato que es el almidón. Sin embargo, el porcentaje de actividad no esta estrechamente ligado con el pH óptimo; ya que el pH óptimo es aquel en donde la enzima tiene condiciones adecuadas para su actividad enzimática sin afectar a su estructura para así evitar la desnaturalización de la misma. El pH óptimo obtenido experimentalmente de la β-‐amilasa es 4,9948, el cual indica que a este pH la enzima no se ve afectada tanto en su estructura como en su porcentaje de actividad. También, se puede concluir que el pH óptimo experimental se asemeja al bibliográfico ya que la β-‐amilasa tiene un pH optimo bibliográfico de 5 a 6. BIBLIOGRAFÍA §
ALDAVE, M. (2011). “Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería”. Recuperado de: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-‐biol-‐mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINÉTICA.pdf
§
FERSHT, A. (2009). “Estructura y mecanismo de las enzimas”. Ed. Reverte. P.p: 149
§
KOLMAN, J. (2008). “Color Atlas of Biochemestry”. Segunda edición. New York, USA. pp: 90,91
§
QUESADA, S. (2008). “Manual de experimentos para laboratorio de Bioquímica”. Recuperado de: https://books.google.com.ec/books?id=8SAtkthrFEkC&dq=efectos+del+ph+sobre+la+activi dad+enzimatica&hl=es&source=gbs_navlinks_s
§
TESIFONTE, T. (2012). “Método para diseñar alfa-‐amilasa con propiedades predeterminadas”. Recuperado de: http://www.oepm.es/pdf/ES/0000/000/02/39/09/ES-‐ 2390901_T3.pdf
§
VOET, D. (2008). “Fundamental of Biochemestry”. pp: 361-‐370
Ingeniería de las enzimas. 5
ANEXOS CÁLCULOS: a) Curva estándar de maltosa. Tabla # 1: “Curva estándar de maltosa” Tubo Vol maltosa (ml) Peso (g) Vol agua (ml) Blanco 0,000 0,000 0,600 Std 1 0,120 0,110 0,480 Std 2 0,240 0,230 0,360 Std 3 0,360 0,370 0,240 Std 4 0,480 0,480 0,120 Std 5 0,600 0,590 0,000 Fuente: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas Elaborado por: Fiallos, J. (2015)
Peso T (g) 0,600 0,600 0,600 0,630 0,600 0,590
Abs 0,000 0,116 0,306 0,463 0,614 0,777
Maltosa (mg/ml) 0,0000 0,3703 0,7743 1,1863 1,6160 2,0200
Solución m adre. Peso: 0,0101 g Volumen solución: 5 ml Concentración solución madre:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 (𝑔) 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝑙)
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
0,0101 𝑔 5 𝑚𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 2,02 𝑔
Concentración Maltosa:
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = [𝑆𝑜𝑙. 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒]×
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 2,02
𝑚𝑔 0,110 𝑔 × 𝑔 0,60 𝑔
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 0,3703
𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔) 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑇 (𝑔)
𝑚𝑔 𝑔
0,9
0,8 Absorbancia (540 nm)
0,7 0,6 0,5 0,4
y = 0,3885x -‐ 0,0071 R² = 0,99826
0,3 0,2 0,1 0 -‐0,1 0
0,5
1 1,5 [Maltosa] mg/ml
Figura # 2: “Curva estándar de maltosa” Ecuación para obtener la concentración de maltosa. 𝑦 = 0,3885 𝑥 − 0,0071 𝐴𝑏𝑠 = 0,3885 [𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎] − 0,0071 𝐴𝑏𝑠 + 0,0071 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 0,3885 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 2,574 𝐴𝑏𝑠 + 0,01827 b) pH real de la reacción. Tabla # 2: “Valores de pH”
pH 3,0 3,5 4,0 6,0 6,5 7,0
pH sustrato 2,424 2,999 3,559 5,806 6,335 6,949
pH real 2,7542 3,2142 3,6622 5,4598 5,8830 6,3742
Fuente: Laboratorio de Ingeniería d e las Enzimas Elaborado por: Fiallos, J. (2015)
2
2,5
Ingeniería de las enzimas. 7 Ecuación para determinar el pH real de la reacción: pH de la enzima: 4,075 𝒑𝑯 𝒓𝒆𝒂𝒍 =
𝟒 𝟏 𝒑𝑯 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐 + 𝒑𝑯 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂 𝟓 𝟓
4 1 𝑝𝐻 𝑟𝑒𝑎𝑙 = (2,424) + (4,075) 5 5
𝑝𝐻 𝑟𝑒𝑎𝑙 = 2,7542 Ecuación para determinar la velocidad inicial relativa:
𝑑𝑃 = 𝑉! 𝑑𝑡 𝑑𝑃 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 !!"# − 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 𝑑𝑡 3𝑚𝑖𝑛 − 0𝑚𝑖𝑛
!!"#
𝒅𝑷 𝑴𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 𝟑𝒎𝒊𝒏 = 𝒅𝒕 𝟑𝒎𝒊𝒏 𝑉! =
0,7107
𝑚𝑔
3𝑚𝑖𝑛
𝑔
𝑉! = 0,2369
𝑚𝑔 𝑔 𝑚𝑖𝑛
Ecuación para determinar el % de actividad relativa: 𝑨𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒂 (%) =
𝑽𝒑𝑯 𝑽𝒎á𝒙
𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 % =
×𝟏𝟎𝟎
0,2609 ×100 0,5089
𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 % = 51,2674
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA β-‐amilasa Johanna Elizabeth Fiallos Núñez Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Ingeniería Bioquímica. Universidad Técnica de Ambato. Ambato – Ecuador.
RESUMEN La actividad catalítica de la enzima β-‐amilasa se determinó mediante el estudio del efecto del pH sobre la misma; la enzima fue sometida a distintos valores de pH, realizando en total 6 ensayos. Para la obtención del pH óptimo de la enzima, en donde alcanza su máxima actividad catalítica, se calculó el porcentaje de actividad mediante la aparición de maltosa como producto. El pH de la enzima donde se evidenció mayor actividad es de 5,4598; sin embargo al calcular el pH óptimo de la enzima se obtuvo un valor de 4,9948, siendo este el pH en donde la enzima presenta una buena actividad catalítica. INTRODUCCIÓN La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado ó sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación del enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción (ALDAVE, 2011). La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reacción. La curva actividad-‐pH puede ser diferente para cada tipo de enzima. En el caso más general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es máxima se denomina pH optimo; dicho pH no tiene porqué coincidir con el pH intracelular. La relación entre el pH y la actividad depende del comportamiento ácido-‐base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su grado de disociación dependiente del pH, lo que determinará, entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unión del sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de los enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la catálisis (ALDAVE, 2011). El presente trabajo tiene como objetivo determinar la influencia del pH sobre la actividad de la enzima B-‐amilasa así como también su pH óptimo.
MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml): Se preparó las soluciones de ácido acético y acetato de sodio 0,02M y se las mezclo hasta conseguir que el pH de la mezcla sea de 4,5 (relación de mezcla aproximada de 1:1). Soluciones tampón citrato-‐fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml): Se mezclaron las soluciones de ácido cítrico (0,05 M) y fosfato dibásico de sodio (0,1 M) de modo que el pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados. Soluciones de almidón al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-‐fosfato: Se pesó la cantidad de almidón soluble correspondiente y se suspendió en 20 ml de tampón citrato-‐fosfato, se calentó la suspensión bajo agitación y se dejó hervir durante 3 min. Se enfrió y restituyo el agua evaporada. Se midió el valor de pH de cada sustrato (valor real que será usado para la gráfica y el cálculo del pH óptimo). Solución de enzima 1/40 en tampón acetato (10 ml).-‐ Se preparó la dilución final de la enzima por diluciones sucesivas (1ª dil 1/10; 3,0 mL) y (2ª ¼; 10 mL). Preparación de la curva estándar de Maltosa: Se utilizaron los valores de absorbancia y concentraciones de la curva estándar de maltosa de la práctica 1. Determinación de la actividad inicial a 20 °C: Se colocó en una gradilla 36 tubos bacteriológicos perfectamente lavados y marcados con el valor de pH; 3 tubos por cada valor de pH más un blanco. Se añadió a cada tubo 0,4 ml de la solución de sustrato y se los termostatizó a 20°C al igual que la solución de enzima por 10 minutos. Se agregaron 0,1 ml de la solución de enzima a cada una de las réplicas, se dejó que la reacción proceda durante 3 minutos y se detuvo la reacción con la adición de 0,5 ml de solución de DNS. Se mezcló bien, se dejó hervir por 5 minutos, se enfrió, se añadió 5 ml de agua destilada y se leyó la absorbancia a 540 nm frente a un blanco preparado invirtiendo el orden de adición de los reactivos (enzima, DNS y sustrato). RESULTADOS La estructura tridimensional de una enzima de origen proteico determina su sitio catalítico y, por lo tanto, su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no covalentes (hidrofóbicos, puentes de hidrógeno, atracciones electrostáticas) y covalentes (puentes de disulfuro) que existen entre los grupos R de los aminoácidos. Los cambios de pH modifican las cargas de los grupos R de los aminoácidos que no son neutros, e interfieren con las atracciones electrostáticas y su estabilidad estructural tridimensional, lo que provoca una pérdida total o parcial de la actividad enzimática. (QUESADA, 2008) Las enzimas son proteínas, como tales poseen grupos ionizables cuyo estado depende del valor del pH; por lo tanto la acción de las enzimas se altera al variar éste parámetro y es preciso controlarlo por medio de un tampón si se quiere obtener resultados concordantes. La influencia del pH sobre la actividad catalítica de la enzima β-‐amilasa fue estudiada experimentalmente mediante la
Ingeniería de las enzimas. 3 realización de 8 ensayos en donde los pH a los cuales la enzima fue sometida son los siguientes: 3.0, 3.5, 4.0, 6.0, 6.5, 7.0. Experimentalmente, se estudió la actividad de la enzima β-‐amilasa a distintos valores de pH, la cual se ve afectada por la concentración de iones de hidrógeno presentes en el medio afectando el grado de ionización de los aminoácidos presentes en el sitio activo. En general, la mayoría de las enzimas son activas dentro de un estrecho rango de pH, siendo de 5 a 9. Esto es consecuencia de los efectos de pH sobre la unión del sustrato a la enzima, la actividad catalítica de la enzima, la ionización del sustrato y la variación de la estructura proteica. Se utilizó almidón como sustrato para la enzima β-‐amilasa, la cual generó como producto maltosa; la generación de producto permite evidenciar la actividad de la enzima β-‐ amilasa sometida a distintos valores de pH.
In.luencia del pH sobre la velocidad catalítica de la β-‐amilasa
% Actividad
85,00 65,00
y = -‐8,9776x2 + 89,682x -‐ 126,31 R² = 0,8667
45,00 0.003 0.003 0.004 0.004 0.005 0.005 0.006 0.006 0.007 0.007 pH
Figura # 1: “Efecto del pH sobre la actividad catalítica de la β-‐amilasa” A cierto pH las cargas de los residuos de los aminoácidos que participan en el sitio activo están en condiciones óptimas para la actividad catalítica sobre el sustrato correspondiente. Por lo tanto, a ese pH la velocidad de la reacción será máxima y ese pH es conocido como pH optimo de la enzima. Por supuesto, en valores de pH demasiado ácidos o alcalinos, no solamente podrá estar modificado el sitio activo, sino que la estructura terciaria de toda la molécula se encontrara alterada y no habrá actividad enzimática. El pH óptimo de la enzima β-‐amilasa es de 4,9948, en donde la enzima adquirió su mayor actividad catalítica y este fue calculado mediante regresión cuadrática ya que la grafica presenta una curva en forma de campana lo que refleja la ionización de residuos de aminoácidos que deben estar en un estado de ionización especifico para tener actividad enzimática. El pH óptimo de la enzima β-‐amilasa bibliográfico es de 5 a 6 lo cual indica que el obtenido en el laboratorio esta dentro del rango ya que presenta un pH óptimo de 4,9948.
CONCLUSIÓN Se determinó la influencia que tiene el parámetro de pH sobre la actividad de la enzima β-‐amilasa, en donde se puede concluir que la enzima presenta mayor porcentaje de actividad a 5,4598 ya que ahí se observa mayor producción de maltosa a partir del sustrato que es el almidón. Sin embargo, el porcentaje de actividad no esta estrechamente ligado con el pH óptimo; ya que el pH óptimo es aquel en donde la enzima tiene condiciones adecuadas para su actividad enzimática sin afectar a su estructura para así evitar la desnaturalización de la misma. El pH óptimo obtenido experimentalmente de la β-‐amilasa es 4,9948, el cual indica que a este pH la enzima no se ve afectada tanto en su estructura como en su porcentaje de actividad. También, se puede concluir que el pH óptimo experimental se asemeja al bibliográfico ya que la β-‐amilasa tiene un pH optimo bibliográfico de 5 a 6. BIBLIOGRAFÍA §
ALDAVE, M. (2011). “Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería”. Recuperado de: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-‐biol-‐mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINÉTICA.pdf
§
FERSHT, A. (2009). “Estructura y mecanismo de las enzimas”. Ed. Reverte. P.p: 149
§
KOLMAN, J. (2008). “Color Atlas of Biochemestry”. Segunda edición. New York, USA. pp: 90,91
§
QUESADA, S. (2008). “Manual de experimentos para laboratorio de Bioquímica”. Recuperado de: https://books.google.com.ec/books?id=8SAtkthrFEkC&dq=efectos+del+ph+sobre+la+activi dad+enzimatica&hl=es&source=gbs_navlinks_s
§
TESIFONTE, T. (2012). “Método para diseñar alfa-‐amilasa con propiedades predeterminadas”. Recuperado de: http://www.oepm.es/pdf/ES/0000/000/02/39/09/ES-‐ 2390901_T3.pdf
§
VOET, D. (2008). “Fundamental of Biochemestry”. pp: 361-‐370
Ingeniería de las enzimas. 5
ANEXOS CÁLCULOS: a) Curva estándar de maltosa. Tabla # 1: “Curva estándar de maltosa” Tubo Vol maltosa (ml) Peso (g) Vol agua (ml) Blanco 0,000 0,000 0,600 Std 1 0,120 0,110 0,480 Std 2 0,240 0,230 0,360 Std 3 0,360 0,370 0,240 Std 4 0,480 0,480 0,120 Std 5 0,600 0,590 0,000 Fuente: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas Elaborado por: Fiallos, J. (2015)
Peso T (g) 0,600 0,600 0,600 0,630 0,600 0,590
Abs 0,000 0,116 0,306 0,463 0,614 0,777
Maltosa (mg/ml) 0,0000 0,3703 0,7743 1,1863 1,6160 2,0200
Solución m adre. Peso: 0,0101 g Volumen solución: 5 ml Concentración solución madre:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 (𝑔) 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝑙)
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
0,0101 𝑔 5 𝑚𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 2,02 𝑔
Concentración Maltosa:
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = [𝑆𝑜𝑙. 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒]×
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 2,02
𝑚𝑔 0,110 𝑔 × 𝑔 0,60 𝑔
𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 0,3703
𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔) 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑇 (𝑔)
𝑚𝑔 𝑔
0,9
0,8 Absorbancia (540 nm)
0,7 0,6 0,5 0,4
y = 0,3885x -‐ 0,0071 R² = 0,99826
0,3 0,2 0,1 0 -‐0,1 0
0,5
1 1,5 [Maltosa] mg/ml
Figura # 2: “Curva estándar de maltosa” Ecuación para obtener la concentración de maltosa. 𝑦 = 0,3885 𝑥 − 0,0071 𝐴𝑏𝑠 = 0,3885 [𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎] − 0,0071 𝐴𝑏𝑠 + 0,0071 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 0,3885 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 2,574 𝐴𝑏𝑠 + 0,01827 b) pH real de la reacción. Tabla # 2: “Valores de pH”
pH 3,0 3,5 4,0 6,0 6,5 7,0
pH sustrato 2,424 2,999 3,559 5,806 6,335 6,949
pH real 2,7542 3,2142 3,6622 5,4598 5,8830 6,3742
Fuente: Laboratorio de Ingeniería d e las Enzimas Elaborado por: Fiallos, J. (2015)
2
2,5
Ingeniería de las enzimas. 7 Ecuación para determinar el pH real de la reacción: pH de la enzima: 4,075 𝒑𝑯 𝒓𝒆𝒂𝒍 =
𝟒 𝟏 𝒑𝑯 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐 + 𝒑𝑯 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂 𝟓 𝟓
4 1 𝑝𝐻 𝑟𝑒𝑎𝑙 = (2,424) + (4,075) 5 5
𝑝𝐻 𝑟𝑒𝑎𝑙 = 2,7542 Ecuación para determinar la velocidad inicial relativa:
𝑑𝑃 = 𝑉! 𝑑𝑡 𝑑𝑃 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 !!"# − 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 = 𝑑𝑡 3𝑚𝑖𝑛 − 0𝑚𝑖𝑛
!!"#
𝒅𝑷 𝑴𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 𝟑𝒎𝒊𝒏 = 𝒅𝒕 𝟑𝒎𝒊𝒏 𝑉! =
0,7107
𝑚𝑔
3𝑚𝑖𝑛
𝑔
𝑉! = 0,2369
𝑚𝑔 𝑔 𝑚𝑖𝑛
Ecuación para determinar el % de actividad relativa: 𝑨𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒂 (%) =
𝑽𝒑𝑯 𝑽𝒎á𝒙
𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 % =
×𝟏𝟎𝟎
0,2609 ×100 0,5089
𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 % = 51,2674
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