Fundamentos De La Electroforesis La Electroforesis Es La Migración De Solutos Iónicos Bajo La Influencia De Un Campo Eléctrico 294i3y

FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatografía basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas poli peptídicas de las proteínas. PRICIPIO La electroforesis se basa en el principio de que una molécula colocada en un campo eléctrico migra al electrodo apropiado a una velocidad (movilidad electroforética), proporcional al campo de fuerza y a su propia carga neta. Por esta razón, una mezcla de moléculas de DNA (o de proteínas), puede separarse electroforéticamente en función de: a) el tamaño, b) la forma o conformación molecular y c) la magnitud de las cargas netas. Cuando se coloca una mezcla de moléculas en la misma posición en un campo eléctrico, los componentes individuales se resuelven en bandas discretas que migran en distintas posiciones. En soluciones acuosas en condiciones fisiológicas, los grupos fosfato de los ácidos nucleicos se encuentran ionizados con una carga negativa (aniones) por lo que migrarán al electrodo positivo (ánodo), cuando son sometidos a un campo eléctrico. Asimismo, al aumentar la viscosidad del medio o soporte en el que migran las moléculas, las de menor peso molecular se moverán con mayor facilidad que las de tamaños mayores, y así las moléculas son separadas exclusivamente en función de su tamaño. Los soportes más utilizados en los métodos de separación por electroforesis son la agarosa y la poliacrilamida. La agarosa forma geles o gelatinas al establecer puentes de hidrógeno cuando se encuentra en soluciones acuosas frías; el tamaño del poro, a través del cual deben migrar las moléculas de ácidos nucleicos, depende directamente de la concentración de la agarosa. Los geles de poliacrilamida se generan por el entre- cruzamiento covalente de los polímeros de acrilamida y su monómero bisacrilamida. Con estos polímeros puede obtenerse

una amplia gama de tamaños de poro variando las proporciones de acrilamidabisacrilamida y el grado de polimerización y de esta manera se controla el tamaño del fragmento de DNA que se mueve por el gel. Por regla general, los geles de agarosa al 1% pueden resolver y separar fragmentos lineales de DNA en el rango de 30 a 0.2 kilonucleótidos (30 000 a 200 nucleótidos), mientras que los geles al 7.5% de poliacrilamida resuelven fragmentos de 2 a 0.05 kilonucleótidos (2 000 a 50 nucleótidos). Los fragmentos de DNA sometidos a electroforesis se pueden visualizar si se les tiñe, por ejemplo, con sustancias que fluorecen al ser irradiadas con luz ultravioleta, como es el caso del bromuro de etidio. Para ello, los geles de agarosa o acrilamida se sumergen directamente en una solución de este compuesto, el cual se intercala entre las dos hélices del DNA, y así las bandas de DNA se observan de color blanco-naranja al irradiar el gel con luz ultravioleta. Importa destacar que la intensidad de la tinción es directamente proporcional al tamaño de los segmentos de DNA; en consecuencia, las bandas de mayor peso molecular tendrán fluorescencia más intensa que las bandas de menor peso molecular (figura II.9). Cada fragmento de DNA observado en el gel representa una población homogénea en tamaño de moléculas de DNA, de modo que el análisis de patrones de restricción de genomas pequeños o segmentos de DNA clonados constituye un poderoso método para el estudio de estos DNAs. TIPOS DE ELECTROFORESIS Existen dos modalidades de electrofóresis: Electrofóresis libre: El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones . Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución. Electroforesis zonal Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo. Son útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución de tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección

del solvente. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etcétera. Factores que afectan la electroforesis El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la máxima resolución. Campo eléctrico Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez, depende de diferentes parámetros: • Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo eléctrico. Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración. Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios. • Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica. Esta relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm: V=IR y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas. • Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la concentración del tampón de electroforesis. • Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético. Todo esto justifica, por sí solo, la necesidad de un sistema de refrigeración en las cubetas de electroforesis.

Tampón Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las moléculas a separar. Normalmente, se emplean tampones con fuerzas iónicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la característica que debe ser más controlada, puesto que determina la carga de la muestra. Conviene señalar también que atendiendo a la distribución del tampón, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un único tampón en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y composición diferentes. MICROPIPETAS La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicascientíficas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, iten un máximo de 20, 200 y 1000μl,respectivamente. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas: 0,1-2,5 µl 2,0-20 µl 0,5-10 µl 50-200 µl 500-2 500 µl 100-1 000 µl

Negro Gris/Amarillo Gris Amarillo Rojo Azul

USO DE LA PIPETA Para obtener resultados exactos, precisos y sobre todo confiables, es necesario que los operadores de pipetas conozcan en detalle los procedimientos relacionados con su utilización. 1. Verificar que la pipeta se encuentra en posición vertical, cuando se requiera aspirar un líquido. La posición vertical garantiza que no se presente incertidumbre por variaciones mínimas en la cabeza del líquido. 2. Confirmar la recomendación que efectúa el fabricante de la pipeta con relación a la profundidad mínima de inmersión de la punta de la pipeta, cuando se requiere aspirar líquidos. Las profundidades varían de acuerdo con el tipo y capacidad de la pipeta.

3. Humedecer previamente las puntas de las pipetas que funcionan por desplazamiento de aire para mejorar la exactitud. Para lograr la humidificación mencionada, se opera varias veces la pipeta con la solución de trabajo, dispensando el contenido en el recipiente de desperdicio. 4. Remover, después de llenar la pipeta, cualquier gota que se adhiera a la punta de la pipeta. El procedimiento que se sigue consiste en tocar, con la punta de la pipeta, suavemente la pared del recipiente que contiene el líquido aspirado. Podría requerirse un material absorbente, teniendo cuidado de no tocar el orificio de la punta de la pipeta y tomando las precauciones del caso, si el material presenta algún tipo de contaminación. 5. Dispensar el líquido contenido en la pipeta tocando con la punta de esta la pared del recipiente receptor. La punta de la pipeta debe formar un ángulo con la pared

Tipos Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Microlitro [µl]. Unidad de capacidad que equivale a 1 x 10-6 litros (l). Un (1) µl de agua pesa exactamente un (1) mg y tiene un volumen de 1 mm3 .

Blues, J., Bayliss, D., Buckley, M., The calibration and use of piston pipette, UK, National Physical Laboratory, Teddington, Middlesex, 2004, pág. 6. (www.npl.co.uk)

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