Informe-8-completo.docx 6u384t

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

MESA: NO 5 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRÁCTICA N0 8 DETERMINACIÓN DE GLUCÓGENO HEPÁTICO Integrantes: ● Espíritu Canchanya, Oscar Andrés (20160436) ● Inga Rojas, Cecilia Felicita (20160352) ● Vera Carrasco, Alexandra Fiorella (20160462) ● Yalta Aliaga, Anderson Alexsander (20161468) ● Yucra Palacios, Milagros Yenifer (20160465) Grupo (día/hora): F* - lunes – 2pm a 4pm Fecha de la práctica: 04-06-18 Fecha de entrega del informe: 11-06-18

2018 – I

1. Introducción El glucógeno es el principal carbohidrato de almacenamiento en animales; corresponde al almidón en los vegetales; es un polímero ramificado de α-d-glucosa. Se encuentra sobre todo en hígado y músculos. Aunque el contenido de glucógeno en hígado es mayor que en músculos, dado que la masa muscular del cuerpo es bastante mayor que la del hígado, alrededor de tres cuartas partes del glucógeno corporal total están en el músculo. El glucógeno del músculo proporciona una fuente de glucosa fácilmente disponible para glucólisis dentro del músculo en sí. La función del glucógeno hepático es almacenar glucosa y exportarla para mantener la glucosa sanguínea entre las comidas. Cuando la concentración de glucosa sanguínea disminuye, el glucógeno se hidroliza rápidamente dando unidades de glucosa libre que pasan a la sangre para mantener sus niveles normales. Después de 12 a 18 horas de ayuno, el hígado casi agota su reserva de glucógeno. El glucógeno muscular sólo disminuye de manera significativa después de ejercicio vigoroso prolongado. Puede inducirse un almacén mayor de glucógeno muscular con dietas ricas en carbohidratos después de la depleción por el ejercicio. Los objetivos de esta práctica número ocho, en donde trabajamos con hígado de pescado, es determinar la presencia y cuantificación del glucógeno hepático empleando el método espectrofotométrico de la antrona, el cual tiene dos ventajas como reactivo, siendo una de ellas el calor de reacción desprendido, y la otra es su estabilidad a lo largo del tiempo.

2. Resultados *Preparamos los tubos de trabajo y calculamos su absorbancia a un λóp = 620nm en el espectrofotómetro. Absorbancia Tubo Blanco = 0.086 Tubo Estándar = 0.141 Tubo Muestra = 0.524 Absorbancia corregida Tubo Blanco = 0.086 – 0.086 = 0 Tubo Estándar = 0.141 – 0.086 = 0.055 Tubo Muestra = 0.524 – 0.086 = 0.438 Absorbancias de todas las mesas de laboratorio A Mesa 1 Mesa 2 Mesa 3 Mesa 4 Mesa 5 Mesa 6

Tubo blanco 0.086 0.086 0.086 0.086 0.086 0.086

Tubo estándar 0.167 0.176 0.168 0.170 0.141 0.137

Tubo muestra 0.526 0.866 0.633 0.463 0.524 1.274

Evaluación estadística (Tubo estándar) Promedio muestral = 0.1598 Desviación estándar muestral = 0.0165 Coeficiente de variabilidad muestral = 10.3254 % Intervalo de la media poblacional (u) con un nivel de confianza del 95% 0.1598 - t (0.975, 5) x0.0165/√𝟔≤ u ≤ 0.1598+ t (0.975, 5) x0.0165/√𝟔 0.1598 – 2.571x0.0165/√𝟔 ≤ u ≤ 0.1598 + 2.571x0.0165/√𝟔 0.1425 ≤ u ≤ 0.1771 Evaluación estadística (Tubo Muestra) Promedio muestral = 0.7143 Desviación estándar muestral = 0.3091 Coeficiente de variabilidad muestral = 43.2731 % Intervalo de la media poblacional (u) con un nivel de confianza del 95% 0.7143 - t (0.975, 5) x0.3091/√𝟔≤ u ≤ 0.7143+ t (0.975, 5) x0.3091/√𝟔 0.7143 – 2.571x0.3091/√𝟔 ≤ u ≤ 0.7143 + 2.571x0.3091/√𝟔 0.3899 ≤ u ≤ 1.0387

Tubo Estándar * Extraemos una alícuota de 0.25mL de la Sol. Estándar de Glucosa 5mg% y la trasvasamos al tubo Estándar. 5mg-------------100ml X ------------- 0.25ml X =0.0125 mg * Completamos el Tubo Estándar con 1.5 ml del Reactivo de Antrona y conseguimos un volumen final de 1.75 mL, a partir de esto calculamos la concentración de la solución estándar. 0.0125mg-------------1.75ml 7.143x10-3mg ------------- 1ml CST =7.143x10-3 mg/ml *Calculamos la concentración desconocida de glucosa del tubo muestra, a partir de su absorbancia corregida y el factor de calibración. CM = (Cst/Ast)AM CM = (7.143x10-3/0.055)0.438 CM = 0.0569 mg/ml *A partir de la concentración de glucosa obtenida calculamos la concentración que habría en el volumen total de 1.75ml del tubo muestra. 0.0569mg-------------1ml X ------------- 1.75ml X =0.0996mg *Esta concentración es la misma que la alícuota de 0.25ml extraída de la fiola, a partir de esta calculamos la concentración que habría en 100ml del recipiente (solución de Glucosa).

0.0125mg-------------1.75ml 0.0996mg-------------0.25ml X ------------- 100ml XX------------1ml =39.840mg -3

X =7.143x10 mg g Hígado 39.840mg Glucosa-------------0.5 0.5 g Hígado-------------100% 39.840x10-3 g Glucógeno ------------- X X = 7.968 % de glucosa (p/p) X0.9

39.840mg Glucosa-------------0.5 g Hígado 35.856 mg Glucógeno------------- 0.5 g Hígado 0.5 g Hígado-------------100% 35.856x10-3 g Glucógeno ------------- X X = 7.1712 % de glucógeno (p/p)

3. Discusiones El glucógeno se puede liberar del hígado por calentamiento con una base fuerte, hasta la destrucción total del tejido. Al añadir ácido ticloroacético al homogeneizado anterior, precipitan numerosas sustancias de peso molécula elevado, como las proteínas y los ácidos nucleícos, en tanto que el glucógeno continúa disuelto. El glucógeno puede separarse de los monosacáridos y otros compuestos hidrosolubles por precipitación con alcohol, porque los polisacáridos son

0.0125mg-------------1.75ml

mucho menos solubles en alcohol acuoso que los monosacáridos. La determinación del grado de pureza de la preparación obtenida se puede realizar mediantes tratamiento con antrona y comparando con una solución estándar. (Dapena (sf)). El glucógeno es extraído del tejido (hepático o muscular) mediante tratamiento con KOH (30%) hirviente. Con este tratamiento, las proteínas y lípidos complejos son hidrolizados, pero no el glucógeno. (Hernández 1988). En nuestra práctica de laboratorio para la determinación de glucógeno en el hígado de un pez, utilizamos para liberar el glucógeno del hígado 1 mL de KOH para 0.5g de hígado de pez con un calentamiento de 30 min para que se pueda hidrolizar las proteínas y lípidos complejos por hidrólisis básica para evitar interferencias. También utilizamos alcohol para precipitar y así poder determinar su grado de pureza con la acción del reactivo de antrona. Cuando se adiciona etanol, el glucógeno se hace insoluble y los otros compuestos permanecen en solución. El glucógeno insoluble es luego separado por centrifugación y determinado como glucosa, sin previa hidrólisis. (Hernández, 1988). El método de determinación de glucógeno es un método que combina la purificación de esta macromolécula (basada en su precipitación con etanol) con un método químico, que se fundamenta en la formación de un derivado coloreado que permite su cuantificación. (Roca. et. al. 2004). En nuestra practica se le añade 5 mL etanol para precipitar la glucosa obtenido de 0.5g de hígado de pez se utiliza el método químico como menciona Roca con el reactivo de antrona permitiendo así obtener el complejo coloreado que nos permita hacer las medidas correspondientes en el espectrofotómetro. Según Valderrama (2000) la reacción de los carbohidratos con antrona en ácido sulfúrico produce un color azul-verdoso característico que ha sido atribuido al producto de la reacción entre el hidroximetilfurfural o el furfular con la antrona que se determina espectroscópicamente a 630 nm. En nuestra práctica unos mililitros de ácido sulfúrico a la glucosa se vuelven en hidroximetilfurfural después añadiéndolo la antrona y poniéndolo en baño maría por 10 min se obtiene el complejo coloreado (azul-verdoso) que después de esperar unos minutos y poder enfriar todos nuestros tubos por completo se mide con una lambda de 620nm. Después de la previa digestión con KOH y precipitación con etanol el glucógeno es determinado espectrofotométricamente mediante la reacción con antrona. La antrona es un derivado fenólico que forma complejo coloreado con todos los carbohidratos, excepto alditoles y aminoazúcares. La reacción de los glúcidos con antrona es muy sensible y tiene como fundamento la conversión en medio ácido de los carbohidratos en derivados furfúricos, los cuales reaccionan con la antrona produciendo un color azul verdoso. (Hernández, 1988) Al calentar pentosas y hexosas en presencia de un ácido fuerte, se deshidratan produciendo un furfural y derivados de hidroximetilfurfural, respectivamente; los grupos aldehído pueden condensarse con un compuesto fenólico, dando un producto coloreado. (Roca.et.al .2004). Como lo mencionan nuestros autores Roca y Hernández nuestra glucosa más el ácido sulfúrico pudieron llegar a formar el hidroximetilfurfural que añadiendo la antrona que como se menciona es un derivado fenólico lo llega a formar como un complejo coloreado

Figura 1: Formación de 5-hidroximetilfurfural a partir de glucosa en medio ácido y su reacción con la antrona. En la siguiente información encontrada de una tesis sobre La respuesta en crecimiento de juveniles de Totoaba macdonaldi alimentados con dietas con diferentes niveles de almidón y lípidos, y adicionadas con un probiótico.

Figura 2: Porcentaje de glucógeno en el hígado del pescado Totoaba macdonaldi alimentados con dietas con diferentes niveles de carbohidratos. El resultado que se obtuvo de glucógeno en el hígado extraído fue 7.1712%, comparando con la tesis, el resultado se encuentra dentro de los rangos establecidos bajo condiciones de alimentación en cantidades mayores.

4. Conclusiones 

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Para determinar la presencia del glucógeno, este es extraído del tejido mediante el reactivo con kOH (30%), con este reactivo las proteínas y lípidos son hidrolizados, pero no el glucógeno, cuando se le adiciona etanol se hace insoluble, este es luego separado por centrifugación y determinado como glucosa. Una vez que el tejido ah sido sometido al reactivo con KOH y etanol, el glucógeno es determinado espectrofotométricamente mediante la reacciona con antrona. La antrona es un derivado fenólico que forma complejo coloreado con todos los carbohidratos, excepto alditoles y amino azúcares. Es fundamental para que nuestro analito se encuentre coloreado y sea detectado por el espectrofotómetro. Al determinar la absorbancia con una longitud de onda de 620 nm utilizado en el espectrofotómetro, con aquellos resultados podemos determinar la concentración de glucosa a partir de una absorbancia corregida y un factor de calibración. Finalmente obteniendo la concentración de glucógeno con el aislamiento y cuantificación.

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El resultado Obtenido de 7.1712% nos proporciona información de que nuestro resultado se encuentra dentro del margen esperado y proporciona confiabilidad en el manejo del procedimiento experimental. Además, el hígado obtenido del espécimen se encuentra dentro del rango estándar y el porcentaje relativamente bajo indica que ha tenido una alimentación balanceada sin exceso de en la dieta. Puede tratarse de un espécimen silvestre en condiciones de alimentación relativamente escasa o de un espécimen de crianza con un porcentaje controlado de su dieta (proteínas, minerales, lípidos).

5. Cuestionario 1. Un paciente excretó 1130 mL de orina en 24 horas. Una alícuota de 2mL se colocó en una fiola de 100mL, se trató con 1mL de reactivo de molibdato y 4 mL de reactivo aminonaftolsulfónico y se diluyó hasta el enrase. De manera similar se preparó una serie de 5 estándares en los que se emplearon 0, 1, 2, 3 y 4 mL de estándar fosfato (de concentración 0.4 mg en 5mL), los que se diluyeron a 100 mL después de añadir los mismos reactivos. Las coloraciones fueron medidas a 660 nm y se obtuvieron los siguientes resultados: ESTÁNDARES 0 1 2 3 4 Orina

ABSORBANCIA 0.000 0.175 0.350 0.525 0.700 0.845

¿Cuántos gramos de fosfato han sido excretados al día? Exprese en g/24 horas. Tubo de 1mL 0.4mg → 5mL 0.08mg ← 1mL

Tubo de 2mL 0.4mg → 5mL 0.16mg ← 2mL

0.08mg → 100mL 8x10-4mg ← 1mL

0.16mg → 100mL 16x10-4mg ← 1mL

C1 = 8x10-4mg/mL

C2 = 16x10-4mg/mL

𝐹𝑐1 =

0.0008 0.175

𝐹𝑐2 =

0.0016 0.350

FC1 = 4.571 x10-3 Tubo de 1mL 0.4mg → 5mL 0.24mg ← 3mL

FC2 = 4.571 x10-3 Tubo de 1mL 0.4mg → 5mL 0.32mg ← 4mL

0.24mg → 100mL 24x10-4mg ← 1mL

0.32mg → 100mL 32x10-4mg ← 1mL

C3 = 24x10-4mg/mL

C4 = 32x10-4mg/mL

𝐹𝑐3 =

0.0024 0.525

FC3 = 4.571 x10-3

𝐹𝑐4 =

FC4 = 4.571 x10-3

FPROMEDIO = 4,571x 10-3 Hallando la concentración de la muestra

0.0008 0.175

CM = FC x AM CM = 4,571x 10-3 x 0.845 CM = 3.86286 x10-3 mg/mL 3.862 x10-3 mg → 1mL 0.386286 mg ← 100mL 0.3862 mg → 2mL 218.2516 mg ← 1130mL 218.203

𝑚𝑔 1𝑔 𝑥 = 𝟎. 𝟐𝟏𝟖𝟐𝟓𝟏𝟔 𝒈/𝟐𝟒𝑯 24𝐻 1000𝑚𝑔

Calcular la concentración de fosfato en milimoles por día. 218.2516

𝑚𝑔 1𝑚𝑜𝑙 1000𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑥 𝑥 = 𝟐. 𝟐𝟗𝟕𝟑𝟖𝒎𝒎𝒐𝒍/𝒅í𝒂 1𝑑í𝑎 95𝑔 1𝑚𝑜𝑙

2. En un análisis espectrofotométrico de colesterol se realizó el siguiente procedimiento. Muestra: 1ml de suero 4.5 ml de reactivo extractante. Estándar: 0.5g/l de colesterol. ¿Cuál es la concentración de colesterol en la muestra de suero? Reactivos Estándar (μL) Muestra tratada (μL) Agua destilada (μL) Reactivo de trabajo (μL) Absorbancia

Tubos Blanco 50.0 3.0

Estándar 10.0 40.0 3.0

Muestra 25.0 25.0 3.0

0.056

0.312

0.350

Tener en cuenta: Suero: 1mL Reactivo Extractante: 4.5mL Volumen total: 5.5mL ASTÁNDAR = 0.312 - 0.056 = 0.256 AMUESTRA = 0.350 – 0.056 = 0.294 Primero hallamos la concentración del tubo estándar: 0.5g → 1000mL 5x10-6 g← 0.01mL=10 μL 5x10-6 g→ (3+0.5) mL 1.64x10-6 g← 1mL CSTÁNDAR = 1.64x10-6g/mL Hallamos la concentración del tubo muestra: 𝑪𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 =

𝑪𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 =

𝑪𝒔𝒕á𝒏𝒅𝒂𝒓 𝒙 𝑨𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝑨𝒔𝒕á𝒏𝒅𝒂𝒓

𝟎.𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟏𝟔𝟒𝒙𝟎.𝟐𝟗𝟒 𝟎.𝟐𝟓𝟔

= 1.88x10-6g/mL

3. Una muestra fue diluida 5 veces y comparada espectrofotométricamente con un estándar de 10 mg/ml, observándose las siguientes absorbancias: ABSORBANCIA ABSORBANCIA CORREGIDA

Blanco: 0.023 -

Estándar: 0.357 0.334

Muestra: 0.677 0.654

¿Cuál es la concentración de la muestra en mg %? 𝑪𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 =

𝑪𝒔𝒕á𝒏𝒅𝒂𝒓 𝒙 𝑨𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝑨𝒔𝒕á𝒏𝒅𝒂𝒓

𝐶𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =

10𝑥0.654 0.334

=19.58mg/mL

Cmuestra(diluida) = (19.58mg/mL) Cmuestra(original o inicial) = (19.58mg/mL)x5 =97.9 mg/mL 97.9 mg → 1mL 9790 mg ← 100mL <> 9790mg% 4. ¿Qué es el glucógeno y cuál es su estructura química? El glucógeno es un carbohidrato de reserva que tienen los animales. Prácticamente todas las células de los mamíferos poseen algo de glucógeno con el motivo de almacenar carbohidratos. Resulta primordialmente abundante en el hígado en concentraciones de 4 al 8% y en las células musculares en menor cantidad, del 0.5 al 1%. En épocas de ayuno (o en periodos de inanición), los animales recurren a estas reservas para suplir la demanda de glucosa necesaria a fin de mantener el estado adecuado del balance metabólico. En términos estructurales, el glucógeno es muy semejante a la amilopectina, pero es mucho más ramificado y tiene ramificaciones más cortas (de 8 a 10 unidades de glucosa de longitud). El glucógeno puede fragmentarse (dividirse) por hidrólisis (reacción con desprendimiento de agua) ácida en subunidades D-glucosa. (Nelson & Cox, 2016) 5. ¿Por qué se realiza la hidrólisis básica? Explique. Se realiza con el fin de lograr el precipitado de glucosa por el cambio de solvente. Luego de colocar la muestra de hígado triturado con KOH en baño María, se enfría con chorros de agua, agregando una cantidad de agua destilada (se centrifuga) y posteriormente una cantidad de etanol de 95% (cambio de solvente); acción que produce el precipitado. A continuación, para evitar que el precipitado de glucosa se adhiera a las paredes del tubo, se le centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos. 6. ¿Por qué se emplea el ácido sulfúrico en la preparación del reactivo de Antrona? Según Rodríguez O.; Vilasó J.; Aguilera I.; Perez R. y Ábalos A. (2013). Es uno de los más utilizados, el cual se ha empleado para determinar azúcares solubles en muestras diversas, como tejidos vegetales, productos biofarmacéuticos, muestras de factor de transferencia y determinación de glicolípidos en diferentes muestras. Se basa sobre la reacción del derivado hidroximetilfurfural (formado por la deshidratación del azúcar en medio ácido caliente) con la antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) para formar un compuesto de color verde con una absorción máxima a 630 nm. Además de ser rápido y sencillo (no requiere un instrumental muy sofisticado), muy utilizado tanto para la detección de glicolípidos como para su cuantificación. Otra ventaja que tiene el método es que se pueden tratar grandes cantidades de muestras a escala de microplacas de titulación. Se emplea el ácido luego de la hidrolización del glucógeno mediante un compuesto alcalino hasta obtener glucosa, en la preparación del reactivo de Antrona para deshidratar al monosacárido, acción que produce derivados del fulfural, los que reaccionan con el reactivo de Antrona y forman un complejo coloreado lo que permite finalmente, obtener el valor de absorbancia requerido.

6. Bibliografía 

Mary K. Campbell, S. O. (2016). Bioquimica. Mexico DF.: Cengage Learning Editores S.A. de C.V.

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Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kenelly, P., Rodwell, V., & Weil, A. (2010). HARPER Bioquímica Ilustrada. México D.F.: McGrawHill.

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Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2016). Lehninger:Principios de Bioquimica . Madrid: Omega.

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Rodríguez-Gámez, O., Vilasó-Cadre, J. E., Aguilera-Rodríguez, I., Pérez Silva, R. M., & Ábalos-Rodríguez, A. (2013). Validación por verificación del método colorimétrico de la antrona para la cuantificación de ramnolípidos. Santiago de Cuba: Revista Cubana de Química.

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Roca. P, Oliver. J y Rodríguez. A. N. 2004. Bioquímica: Técnicas y métodos. Ed. Hélice. pg. 280. Recuperado en : https://books.google.com.pe/books?id=hrd7v5YNo1UC&pg=PA280&dq=determinacion +de+glucogeno+con++antrona&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjh563opZ3XAhUk24MKHe PgCBMQ6AEILTAC#v=onepage&q=determinacion%20de%20glucogeno%20con%20% 20antrona&f=false Valderrama. O. J.2000. Rev. Información Tecnológica. Vol. 11.pg59. Recuperado en: https://books.google.com.pe/books?id=_pmuc2_F0kAC&printsec=frontcover&hl=es&so urce=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false Hernández, Marta. 1988. Manual de Prácticas de Laboratorio. Cuba. Disraely Gonzáles Acevedo. 2011. Tesis sobre La respuesta en crecimiento de juveniles de Totoaba macdonaldi alimentados con dietas con diferentes niveles de almidón y lípidos, y adicionadas con un probiótico. file:///C:/s/Luis/s/Tesis-Disraely-Gonzalez%20(1).pdf

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