Practica 9 Aislamiento Rhizobium 3l6v1t

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTENOLOGÍA Nombre: Rosita Grijalva Richard Gordillo Curso: Quinto “B”

Fecha: 08-07-2009 Práctica Nº 9

TEMA: “AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM, UNA BACTERIA FIJADORA DE NITRÓGENO DE LOS NÓDULOS DE LAS RAÍCES DE LA PLANTA DE CHOCHO SILVESTRE (ERYTHRINA CORALLODENDRON)” INTRODUCCION Entre los microorganismos del suelo que realizan la fijación del nitrógeno atmosférico, los más comunes y efectivos son los del genero Rhizobium, que colonizan y forman nódulos en las raíces de las leguminosas, las bacterias obtienen alimento de la planta y ésta a cambio, recibe compuestos nitrogenados (Instituto Regional Federico Errázuriz). En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana (Elaine R. Ingham, 2000) Se dan dos grandes divisiones de bacterias fijadoras de nitrógeno: las bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas y las bacterias fijadoras de nitrógeno asociativas (Elaine R. Ingham, 2000). Las bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas, tales como el Rhizobium, se dan en las legumbres. Estas bacterias forman nódulos en las raíces de las plantas. Y estos nódulos son fáciles de contar. Las bacterias fijadoras de nitrógeno asociativas ocupan los espacios entre las células de las raíces de la planta, y no alteran la arquitectura de la raíz en absoluto (Elaine R. Ingham, 2000). A finales de la década de los 70, Kloepper (1994) utilizó el término PGPR (plant growth promoting rizobacterias; rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal) para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benéfico en las plantas. Recientemente, la denominación se ha extendido a microorganismos PGP para incluir hongos y cualquier organismo afín (Vessey, 2003). Sin embargo, en la última década un interés creciente ha sido dirigido hacia los microorganismos endófitos, los cuales al estar menos afectados por el estrés ambiental y más aclimatados con su hospedero (Sturz y Nowak, 2000) podrían representar una mayor ventaja ecológica. Sin embargo, la presencia de bacterias endófitas y su papel dependen probablemente del cultivar y de su coevolución con la especie microbiana (Yanni et al., 2001).

El objetivo de esta práctica es aislar bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium de los nódulos de las raíces de la planta de chocho silvestre (Erythrina corallodendron). Se espera también probar diferentes medios de cultivo para el aislamiento de la mayor cantidad de microorganismos fijadores de nitrógeno. Además se espera identificar mediante tinción Gram los microorganismos fijadores de nitrógeno aislados en los medios de cultivo y comparar cuantitativamente en que medio se obtuvo la mayor cantidad de microorganismos. METODOLOGÍA 1. Seleccionar una planta, de preferencia una leguminosa para obtener los nódulos de sus raíces. 2. Escoger una raíz que tenga los nódulos y lavarlo con agua de la llave para eliminar la mayor cantidad de suelo. 3. Desprender cuidadosamente el nódulo de la raíz y colocarlo en una caja petri 4. Colocar en dos cajas petri alcohol y en otra caja agua destilada 5. Con ayuda de una pinza flamearla en el mechero para esterilizarla, coger el nódulo y colocarlo en la caja con agua y dejarlo por 1 minuto. Repetir el procedimiento en las otras dos cajas con alcohol. 6. Colocar el nódulo en otra caja y machacarlo con un estilete o un hisopo hasta obtener un líquido de color rosado. 7. Inocular un 1ml del líquido obtenido en una caja de agar manitol con extracto de levadura y con ayuda de una asa sembrar por estrías. 8. Igual procedimiento hacer en la caja con agar manitol sin extracto de levadura. 9. Invertir las cajas e incubar a temperatura ambiente de 3 a 4 días. RESULTADOS Después de la incubación se pudieron observar los siguientes resultados: Tabla 1: Unidades formadoras de Colonias de Rhizobium en las cajas de cultivo Agar Manitol con extracto de levadura Agar Manitol sin extracto de levadura

125 colonias – 1.25x104UFC 80colonias – 8x103UFC

En el agar Manitol con extracto de levadura se observaron colonias mas separadas, bien definidas, de color blanco aunque en los extremos de la caja se observó un poco de contaminación. En el agar Manitol sin extracto de levadura se pudo observar colonias no en la misma proporción que en el agar con extracto de levadura, aquí también se pudo observar contaminación en la caja y algunas colonias de color blanco y otras que eran de color amarillo. Tabla 1: TINCIÓN GRAM Agar con extracto de levadura Agar sin extracto de levadura

Presencia de Bacterias gram negativas, hongos en mayor proporción, levaduras. Presencia de Bacterias gram negativas, hongos en menor proporción

DISCUSIÓN Los resultados obtenidos después de la práctica se pueden observar en las tablas 1 y 2, los cuales fueron satisfactorios; gracias a la Tinción Gram pudimos observar la presencia de bacterias Gram negativas. Rhizobium es una bacteria gram negativa ampliamente estudiada por su capacidad de fijar nitrógeno al asociarse simbióticamente con plantas leguminosas (Navarro, 1982). Para el aislamiento de las bacterias Rhizobium se utilizó medios de cultivo enriquecidos como es el manitol con extracto de levadura y sin extracto de levadura pudiéndose observar diferencias entre las cajas inoculadas. Rhizobium para su crecimiento requiere de una fuente de carbono obtenida del manitol y una fuente de nitrógeno que la obtiene del extracto de levadura (TIAEM). El extracto de levadura se a considerado como una de las mejores fuente de nitrógeno probadas, lo cual puede explicarse por la presencia de factores de crecimiento requeridos por la bacterias (Rubio, 19991). Es por ello que cuando se vario el medio y se añadió extracto de levadura, se pudo observar una mayor diversidad de microorganismos como indica la tabla 2 y una mayor cantidad de bacterias que se pudo observar mediante la tinción Gram, con respecto al medio solo con manitol. Además de levadura, el medio contiene nitrato de calcio que pudo haber influenciado de cierta manera en el incremento de la población microbiana, este incremento puede deberse al calcio, pues se ha comprobado la importancia de este micronutriente para la bacteria, pues ayuda en el crecimiento de la misma (Norris, 1959), la falta de este elemento produce un debilitamiento en las paredes celulares y en consecuencia, las bacterias producidas son más débiles.

CONCLUSIONES En este trabajo fue posible la inoculación de bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium de los nódulos de las raíces de la planta de chocho silestre (Erythrina corallodendron). Se pudo concluir también, que el medio de manitol con extracto de levadura es el mejor para el aislamiento de bacterias del género Rhizobium ya que reportó los mejores resultados. CUESTIONARIO ¿Por qué el interior de los nódulos de Rhizobium en leguminosas es rosado y para que sirve? Los nódulos varían en su forma (redonda, alargada o ramificada) y tamaño. Depende de la leguminosa, de la cepa de rhizobio, del contenido de N en el suelo y de los factores ambientales. El color interno rojo o rosado indica que los nódulos están activos, por la presencia de leghemoglobina (proteína que interactúa con el oxígeno presente en el medio), si el color es blanco o verde, generalmente son inefectivos Los nódulos son efectivos cuando tienen la capacidad de fijar nitrógeno.

BIBLIOGRAFÍA JOHNSON, H. W., and V. M. MEANS. 1963. Serological groups of Rhizobium jajonicum recovered from nodules of soybean in field soils. Agron. J. 55: 269-271. consultado el 18 de Julio del 2009 Elaine R. Ingham, Andrew R. Moldenke, Oregon State University, Clive A. Edwards, The Ohio State University, Manual sobre la biología del suelo [en línea]. Disponible: soils.usda.gov/sqi/concepts/soil_biology/biology.html. consultado el 18 de Julio del 2009 JOHNSON, H. W., and V. M. MEANS. 1963. Serological groups of Rhizobium jajonicum recovered from nodules of soybean in field soils. Agron. J. 55: 269-271. consultado el 18 de Julio del 2009 ABEL, G. H., and L. W. ERDMAN. 1964. Response of lec soybeans to different strains of Rhizobium japonicum. Agron. J. 56: 423-424. consultado el 18 de Julio del 2009 CALDWELL, B. E., and GRANT VEST. 1968. Nodulation interaction between soybean genotipes and serogroups of Rhizobium japonicum. Crop Sci. 8: 680-682. consultado el 18 de Julio del 2009 Vessey K (2003) Plant growth promoting rhizobacter ia as biofertilizers. Plant Soil 255:571-586. consultado el 18 de Julio del 2009 Yanni Y, Rizkabd El-Fattah Y, Squartini A, Corich V, Giacomini A, De Bruijn F, Rademaker J, Maya-Flores J, Ostrom P, Vega-Hernández M, Hollinswoth R, MartínezMolina E, Mateos P, Velázquez E, Wopereis J, Triplett E, Umali-García M, Anarna J, Rolfe B, Ladha J, Hill J, Mujoo R, Dazzol F (2001) The beneficial plant growthpromoting association of Rhizobium leguminosarum bv. trifolli with rice roots. Aust. J. Plant Physiol. 28: 1-26. consultado el 18 de Julio del 2009 Sturz A, Nowak J (2000) Endophytic communities of rizobacteria and strategies required to create yield enhancing associations with crops. Appl. Soil Ecol. 15: 183-190. consultado el 18 de Julio del 2009 Medios de cultivo generales TIAEM, en línea consultado el 20 de julio del 2009 de http://personal.us.es/espuny/instrumentales/docs/tablas-teoria/Tablas_leccion_5.pdf Norris, D. 1959. The rol of calcium and magnesium in the nutrition of Rhizobium. Aust.J.Agric. Res. Pág: 651-698 consultado el 20 de Julio del 2009 Rubio, M. 1991. Factores que afectan al crecimiento y capacidad de fijar nitrógeno en Bacterias del grupo Rhizobium Leguminosaurum. Tesis Facultad de Ciencias. Departamento de Farmacia. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 133-139 consultado el 20 de Julio del 2009